本论文研究添加不同浓度葡萄糖对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs))葡萄糖摄取和酪蛋白合成的影响,通过对BMECs活力、葡萄糖摄取相关基因mRNA表达量、葡萄糖代谢相关酶活性、酪蛋白合成相关基因mRNA表达量和蛋白表达量的研究,旨在探寻BMECs葡萄糖的适宜供给模式,初步揭示葡萄糖调控酪蛋白合成的分子机制,为调控奶牛乳成分的合成提供理论依据。论文一共包含三部分试验,试验一在二维培养模式下,研究不同浓度的葡萄糖(0、7、10.5、14、17.5 和 21 mmol/L)对 BMECs 葡萄糖摄取量、ATP 含量、葡萄糖转运相关基因mRNA表达量及葡萄糖代谢相关酶活性的影响,筛选葡萄糖的适宜添加量。试验采用单因素完全随机试验设计,将中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞纯化培养后,选取第2代细胞,待细胞生长到80%汇合度时饥饿处理12h,再向培养基中添加不同浓度的葡萄糖。葡萄糖处理12 h以后,使用试剂盒检测细胞培养液中葡萄糖的含量、ATP的合成量以及己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的酶活力;用实时荧光定量PCR检测BMECs葡萄糖转运载体1(GLUT1)、葡萄糖转运载体8(GLUT8)和葡萄糖转运载体12(GLUT12)的mRNA表达量。试验二在二维培养模式下添加不同浓度的葡萄糖(0、7、10.5、14、17.5和21 mmol/L)处理BMECs 12h后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力;用实时荧光定量PCR检测BMECs酪蛋白合成相关基因αs1-酪蛋白(CSN1S1)、κ-酪蛋白(CSN3)、AMP活化蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶分子(mTOR)、真核翻译启始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、核糖体p70s6激酶(S6K1)和真核翻译启始因子4E(eIF4E)的mRNA表达量。试验三在三维培养模式下向BMECs中添加由试验一和试验二筛选出的适宜葡萄糖浓度(0、14和17.5 mmol/L),研究葡萄糖对BMECs酪蛋白合成的影响。用实时荧光定量PCR检测BMECs葡萄糖转运载体及酪蛋白合成相关基因的表达量;用蛋白质印迹法检测BMECs酪蛋白相关基因的蛋白表达水平。试验一结果表明,当葡萄糖浓度高于17.5 mmol/L时,BMECs对葡萄糖摄取率显著下降(P＜0.05);BMECs中ATP合成量与葡萄糖添加浓度呈现剂量依赖效应;添加10.5 mmol/L～21 mmol/L葡萄糖能显著增加BMECs中HK、PK和G6PD的酶活(P＜0.05);当葡萄糖添加剂量为14 mmol/L～17.5 mmol/L时,BMECS中GLUT1和GLUT8的mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05),但对GLUT12的基因表达量无显著影响(P＞0.05)。试验二结果表明,添加葡萄糖显著促进了 BMECs的增殖;17.5 mmol/L葡萄糖处理组的 CSN1S1、CSN3、AMPK、mTOR、S6K1 和 eIF4E 的 mRNA 表达量显著高于对照组(P＜0.05),7 mmol/L葡萄糖处理组4EBP1的mRNA表达量显著高于对照组和其他葡萄糖处理组(P＜0.05),但当葡萄糖添加浓度为21 mmol/L时,BMECs酪蛋白合成相关基因的mRNA表达量有下降的趋势。试验三结果表明,三维培养模式下,14 mmol/L～17.5 mmol/L葡萄糖组GLUT1、GLUT8、GLUT12、β-酪蛋白(CSN2)、CSN3、S6K1 和 eIF4E 的基因表达量显著高于对照组(P＜0.05),但AMPK的基因表达量与对照组相比差异不显著(P＞0.05);14mmol/L葡萄糖组mTOR的基因表达量显著高于17.5mmol/L葡萄糖组和对照组(P<0.05);17.5 mmol/L葡萄糖组4EBP1的基因表达量显著高于高于14mmol/L葡萄糖组和对照组(P＜0.05)。