抗菌肽GL13K涂层钛的抗腐蚀性能检测及其调节巨噬细胞促进成骨、成血管分化的基础研究

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目的:探究纯钛材料表面经抗菌肽GL13K涂层后抗腐蚀性能检测及如何通过调节巨噬细胞行为促进成骨分化、成血管分化。方法:1、纯钛材料表面经抗菌肽GL13K涂层后抗电化学腐蚀性能的变化:(1)通过X射线衍射仪(X-Ray diffraction,XRD)分析纯钛组、硅烷化涂层钛组及抗菌肽GL13K涂层钛组之间表面物相结构的差异;(2)通过电化学阻抗谱(Electrochemical impedance spectroscopy,EIS)检测三组钛材料交流电势与电流信号的比值随正弦波频率ω的变化,根据阻抗数据的奈奎斯特(Nyquist)、波德(Bode)相位和振幅图绘制了与实际测量值相对应的曲线进而分析三组钛材料抗电化学腐蚀性能的差异;2、纯钛材料表面经抗菌肽GL13K涂层后对骨髓间充质干细胞增殖情况的检测:(1)通过CCK-8试剂盒检测直接培养于三组钛材料表面的骨髓间充质干细胞增殖水平的变化;(2)通过免疫荧光染色直接观察三组钛材料表面骨髓间充质干细胞的增殖、聚集情况;(3)通过RT-q PCR从分子水平检测FN、VCL、ITGA3等细胞骨架基因的表达,定量分析三组钛材料表面骨髓间充质干细胞的黏附、增殖情况;3、纯钛材料表面经抗菌肽GL13K涂层后对巨噬细胞RAW 264.7的增殖情况及M1/M2型极化状态的检测:(1)通过CCK-8试剂盒检测直接培养于三组钛材料表面巨噬细胞RAW264.7增殖水平的变化;(2)将M1型巨噬细胞高表达的CD11c和M2型巨噬细胞高表达的CD206作为巨噬细胞极化状态鉴定的标记物,通过流式细胞术从细胞水平检测巨噬细胞标记物,判断巨噬细胞的M1/M2极化状态;4、纯钛材料表面经抗菌肽GL13K涂层后培养巨噬细胞对骨愈合的影响:观察在巨噬细胞刺激条件下,骨髓间充质干细胞在GL13K涂层钛表面的成骨分化潜能及骨形成相关基因表达情况;5、初探纯钛材料表面经抗菌肽GL13K涂层后对血管再生的影响:(1)通过CCK-8试剂盒检测在巨噬细胞刺激条件下,人脐静脉血管内皮细胞HUVECs在GL13K涂层钛表面增殖情况;(2)通过Tanswell迁移实验检测三组钛材料对人脐静脉血管内皮细胞HUVECs成血管分化的影响;(3)通过RT-q PCR从分子水平检测三组材料表面人脐静脉血管内皮细胞HUVECs成血管相关基因的表达差异。结果:1、针对三组钛材料进行的抗腐蚀性能检测中:(1)XRD结果表明,硅烷化涂层钛和抗菌肽GL13K涂层钛的物相结构与纯钛的物相结构图形基本一致,即硅烷化涂层和GL13K涂层未破坏钛材料的内部结构,维持钛材料内部结构稳定性;(2)电化学阻抗谱(EIS)结果中奈奎斯特(Nyquist)曲线的数据显示,纯钛和抗菌肽GL13K涂层钛呈现出较大的阻抗半径,硅烷化涂层钛半径最小,即抗菌肽GL13K涂层钛康电化学腐蚀性能佳;波德(Bode)波幅图上在低频范围内的阻抗模量也表现出相同的变化趋势;2、骨髓间充质干细胞在三组钛材料表面的增殖情况:(1)CCK-8试剂盒检测结果显示骨髓间充质干细胞直接培养于三组材料表面后均随培养时间延长而增殖,且三组间的增殖情况无统计学差异;(2)免疫荧光检测结果显示骨髓间充质干细胞直接培养于三组材料表面后均随培养时间延长而增殖,其中抗菌肽GL13K涂层钛组表面的细胞表出明显的相互聚集现象;(3)RT-q PCR结果显示培养于三组钛材料表面骨髓间充质干细胞的FN、VCL、ITGA3等细胞骨架基因表达量随培养时间延长而增高,且三组间的表达量无统计学差异;3、巨噬细胞在三组钛材料表面的增殖情况:(1)CCK-8试剂盒检测结果显示巨噬细胞直接培养于三组材料表面后均随培养时间延长而增殖,且三组间的增殖情况无统计学差异;(2)GL13K涂层钛在培养初期可激活更高比例的促炎型M1巨噬细胞,而在培养7天后,则发生极化转变,培养21天后以抗炎型M2巨噬细胞为主;4、成骨分化实验结果表明,GL13K涂层钛表面有利于BMSCs成骨分化。其中,ALP染色和ALP、OC和RUNX2基因表达结果无统计学差异。而茜素红染色和COL-1α1基因表达在GL13K涂层钛表面增加;5、本实验构建巨噬细胞与HUVECs在钛材料表面间接共培养的模型,通过CCK-8和Transwell试验表明,GL13K涂层钛组表面为HUVECs的增殖和迁移创造了良好的局部微环境。本研究的结果还表明GL13K涂层钛组表面在不同时间点刺激成血管相关基因(ICAM-1,angs,VEGF-A和KDR)的表达,增加VEGF-A细胞因子的分泌。结论:1、抗菌肽GL13K涂层后钛材料可维持良好的内部结构稳定性,抗电化学腐蚀性能更佳;2、抗菌肽GL13K涂层钛对骨髓间充质细胞和巨噬细胞均表现出良好的生物相容性,有促进骨髓间充质干细胞相互聚集和适当调节巨噬细胞向M2型(抗炎型)极化的趋势,进而促进一系列有利于组织修复的细胞生物学行为发生;3、GL13K涂层钛表面在体外有利于巨噬细胞形成促进组织修复的局部微环境,可促进成骨分化和成血管分化。
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