世界十大卵菌病原体之一的烟草疫霉菌引起的烟草黑胫病是世界性的重要烟草病害之一,其分布范围广泛,发病后对烟草毁灭性极强。据不完全统计,烟草黑胫病给我国带来平均每年上亿元的经济损失,仅次于烟草病毒病。寄主诱导的基因沉默技术是在RNA干扰技术基础上发展起来的,为培育基于病原菌特异序列的抗病植物奠定了基础,显示了巨大的应用潜力。TOR（Target of Rapamycin）激酶信号途径能够响应能量、营养和环境因素来调节转录翻译、生长增殖、新陈代谢等,在真核生物中起重要作用。在前人研究中,以烟草疫霉的TOR基因为靶标设计RNA干扰载体并通过抗性筛选获得了转PnTOR基因烟草,发现转基因烟草的株高、有效叶片数等农艺性状与野生型烟草无显著差异,而对烟草黑胫病的抗性还需进一步研究。本实验对转PnTOR基因烟草T1代和T2代转基因植株进行目的基因遗传检测、基因表达分析、烟草疫霉接菌抗性鉴定及活性氧相关检测,获得稳定遗传的抗黑胫病转基因烟草株系。本研究获得的主要结果如下:1、转PnTOR基因烟草目的基因的检测与鉴定对获得的91株T1代转基因烟草植株进行PCR检测,有79株转基因植株扩增出一段大小为530bp左右的电泳条带,转化率为86.8%,将扩增出条带的PCR产物进行测序,有15个样本的基因序列与目的基因序列一致,基因纯合率为19.0%。对115株T2代转基因烟草植株进行PCR检测,有105株转基因植株扩增出一段大小为530bp左右的电泳条带,稳定遗传概率为91.3%,将扩增出条带的PCR产物进行测序,有45个样本基因序列与目的基因序列一致,基因纯合率为42.9%。表明目的基因片段已经成功整合到烟草基因组DNA中。2、转基因植株中PnTOR的相对表达量和烟草疫霉菌的相对生物量以接菌0 h、12 h、24 h、36 h、48 h的转基因烟草株系‘29-8’和‘35-4’以及野生型烟草的离体叶片进行q RT-PCR定量分析,检测转基因植株中PnTOR的相对表达量和离体叶片上烟草疫霉菌的相对生物量。在0-48 h内,野生型烟草中PnTOR的表达量都非常低,转基因烟草中PnTOR的表达量显著高于野生型烟草;转基因烟草株系‘29-8’中PnTOR的表达量在0-12 h显著升高,12-48 h略有下降。转基因株系‘35-4’中PnTOR的表达量在0-24 h逐渐上升,24-48 h略有波动。0-48 h,转基因烟草株系‘29-8’中PnTOR的表达量均高于转基因烟草株系‘35-4’。接菌0 h时,转基因烟草与野生型烟草植株叶片上的烟草疫霉的相对生物量都极低;0-12 h,转基因烟草与野生型烟草植株叶片上的烟草疫霉的生物量显著升高,12-48 h,转基因烟草与野生型烟草植株叶片上的烟草疫霉生物量均逐渐升高,且转基因烟草植株叶片上烟草疫霉菌的生物量显著低于野生型烟草。实验结果初步表明,转PnTOR基因烟草对烟草疫霉菌具有一定抗性。3、转PnTOR基因烟草在烟草疫霉侵染后对烟草黑胫病抗性对转基因烟草进行离体叶片侵染,T1代转基因烟草和野生型烟草都能被烟草疫霉菌侵染,但转基因烟草株系‘29’、‘30’和‘35’的植株叶片的侵染面积比野生型烟草的侵染面积小16.6%,叶片腐烂程度也比野生型烟草轻,表明部分转基因烟草株系对烟草疫霉菌具有一定抗性。T2代转基因烟草株系‘29-8’和‘35-4’的离体叶片侵染面积分别比野生型烟草叶片侵染面积小13.87%和15.97%,侵染面积显著小于野生型烟草,T2代转基因烟草叶片的腐烂程度也明显轻于野生型烟草,结果表明,在相同的侵染环境中,转PnTOR基因烟草的抗病性显著性提高。对T2代转基因烟草植株进行整株接菌实验后发现,转基因烟草的发病进程比野生型烟草晚2 d左右,转基因株系‘29-8’和‘35-4’的烟草黑胫病的发病率分别为22.23%和55.57%,显著小于野生型烟草的88.87%,病情指数分别为17.29和44.45,显著小于野生型烟草的76.53。结果表明,转PnTOR基因烟草抗烟草黑胫病的能力显著强于野生型烟草。4、转PnTOR烟草叶片活性氧水平用DAB染色和NBT染色分别检验被侵染后的转基因烟草叶片中H2O2水平和O2-水平。结果表明侵染后的叶片中H2O2主要分布在被侵染部位,O2-主要分布在未被侵染部位;转基因烟草中被侵染部位的H2O2水平比野生型烟草中的H2O2水平高,转基因烟草中未被侵染部位的O2-水平比野生型烟草中的O2-水平低。5、转PnTOR烟草在烟草疫霉菌侵染后活性氧清除酶活性检测转基因烟草中活性氧清除相关酶的活性。结果显示,烟草疫霉菌侵染后,转基因烟草和野生型烟草中SOD活性变化规律不明显,在12 h和36 h时,转基因烟草的SOD活性比野生型烟草略低,但在0 h、24 h和48 h时,转基因烟草的SOD活性显著高于野生型烟草。0-48 h,转基因烟草和野生型烟草CAT、POD和PAL活性变化规律均为逐渐升高,转基因烟草中的POD和PAL活性都比野生型烟草中的活性强,但转基因烟草中的CAT活性比野生型烟草中的活性弱。对于总抗氧化能力来说,野生型烟草和转基因烟草株系‘35-4’的总抗氧化能力变化规律均为先降低再升高,而转基因烟草株系‘29-8’的总抗氧化能力变化规律为先短暂升高后降低再升高。转基因烟草的总抗氧化能力比野生型烟草的总抗氧化能力强。6、转PnTOR烟草在烟草疫霉菌侵染后抗氧化相关基因的表达对侵染后的转基因烟草进行q RT-PCR,检测转基因烟草中部分抗氧化基因的表达量。检测结果显示转基因烟草和野生型烟草中Cu/Zn SOD基因、POD基因和CAT基因的表达量都随着侵染时间的增加,表达量逐渐升高,转基因烟草中的Cu/Zn SOD基因和POD基因的表达量比野生型烟草中的表达量高,而转基因烟草中的CAT基因的表达量比野生型烟草中CAT基因的表达量低。综上所述,PnTOR基因已成功转入烟草中,转入的PnTOR基因在烟草体内表达后,通过抑制烟草疫霉菌的生长使转基因植株拥有对烟草黑胫病的抗病性,且转入的PnTOR基因能提高部分抗氧化基因的表达,从而改变活性氧清除酶的活性,使植物体内活性氧水平处于平衡状态,从而提高植株抵抗病菌入侵的能力。