第一部分 LncRNAMEG3在大鼠骨关节炎动物模型中的作用研究目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种慢性关节疾病,目前尚无明确的治疗方法。长链非编码 RNA((Long chain non-encoded RNAS,lncRNA)已被证实在 OA的发展中起重要作用。但是其具体作用机制至今尚未明确。方法:构建大鼠OA模型和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)诱导的大鼠软骨细胞,并且分成 pcDNA,MEG3,si-NC 以及 si-MEG3 组。质粒构建(Maternal expression Gene 3,MEG3表达质粒和sh-MEG3),并对慢病毒进行包装。RT-Qpcr(reverse transcription,PCR)检测大鼠OA模型软骨组织中lncRNA MEG3的表达模式,检测软骨细胞中MEG3的表达情况。根据细胞活力和凋亡评估MEG3对IL-lβ诱导的软骨细胞的影响。包括MEG3敲低和过表达对软骨细胞增殖和凋亡的影响。采用Western blot检测,MEG3敲低和过表达对Bax和Bcl2表达的影响。结果:(1)MEG3在大鼠骨关节炎模型及软骨细胞中的表达变化:从数据中发现,与假手术组软骨组织(n=10)相比,在大鼠OA模型(n=10)的软骨组织中MEG3表达显著降低。(2)MEG3对软骨细胞增殖的影响:MEG3的增殖和IL-1β诱导的软骨细胞的凋亡的影响使用增益的函数的实验通过用MEG3(SI-MEG3)和MEG3过表达载体(小干扰RNA转染的失功能和进行探讨MEG3)。与相应的阴性对照(pcDNA或si-NC)相比,MEG3或si-MEG3的引入显著增强或抑制MEG3的表达(P<0.05)。此外,细胞活力测定显示MEG3上调显著促进软骨细胞增殖,而MEG3敲低显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞的增殖(P<0.05)。(3)MEG3对软骨细胞凋亡的影响:通过流式细胞术和Western印迹分析评估MEG3对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响。数据显示,IL-1β触发软骨细胞凋亡,MEG3上调显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,而MEG3下调表现出相反的效果。Western印迹测定显示MEG3敲低导致软骨细胞凋亡的促进,并且MEG3过表达软骨细胞凋亡抑制,其通过细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl2的表达变化显示(P<0.05)。结论:(1)在大鼠OA模型(n=10)的软骨组织中MEG3表达显著降低。(2)MEG3敲低显著抑制软骨细胞增殖,而MEG3上调显著促进IL-1β诱导的软骨细胞的增殖。(3)MEG3过表达促进IL-1β诱导的软骨细胞的增殖并抑制细胞凋亡。这些结果表明MEG3可能在OA的进展中发挥重要作用。总之,LncRNA MEG3与大鼠骨关节炎的发生发展密切相关,提示可以通过过表达MEG3的表达作用,从而抑制大鼠关节炎的作用。第二部分 miR-16/SMAD7信号通路在大鼠骨关节炎动物模型中的作用研究目的:骨关节炎(OA)是一种慢性关节疾病,目前尚无明确的治疗方法。Micro-RNA已被证实在OA的发展中起重要作用。但是其具体作用机制至今尚未明确,尤其是miR-16/SMAD7信号通路。方法:构建大鼠OA模型和白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的大鼠软骨细胞。质粒构建(miR-16,anti-miR-16,SMAD7 WT,SMAD7 MUT),并对慢病毒进行包装。并且分成 miR-NC,miR-16,anti-miR-NC 以 anti-miR-16 组。RT-qPCR 检测大鼠 OA 模型软骨组织中miR-16的表达模式,检测软骨细胞中miR-16对软骨细胞增殖或凋亡的影响表达情况。根据细胞活力和凋亡评估miR-16对IL-1β诱导的软骨细胞的影响。采用Western blot检测,miR-16对SMAD7表达的影响。采用荧光素酶报告反应,检测miR-16与SMAD7的相互作用。结果:(1)miR-16在大鼠骨关节炎模型及软骨细胞中的表达变化:评估OA中miR-16的作用,在大鼠OA模型的软骨组织中检测到miR-16表达模式。与假手术组相比,大鼠DMM模型的软骨组织中miR-16的表达显著增加(P<0.05)。随后,合成miR-16模拟物和抗miR-16,然后转染入IL-1β诱导的软骨细胞以检查其效率。通过分别转染miR-16模拟物或抗miR-16,miR-16的表达显著增加或减少(P<0.05)。(2)miR-16对软骨细胞增殖的影响:miR-16消耗显著促进IL-1β诱导的软骨细胞的增殖(P<0.05)。另一方面,miR-16过表达明显抑制细胞增殖(P<0.05)。总之,miR-16的过表达抑制IL-1β诱导的软骨细胞的增殖。这些结果提示miR-16可能与OA的发展和进展密切相关。(3)miR-16对软骨细胞凋亡的影响:用miR-16模拟物和抗miR-16探讨miR-16对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡的影响。这些数据揭示,miR-16消耗显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞的凋亡(P<0.05)。另一方面,miR-16过表达明显促进细胞凋亡(P<0.05)。总之,miR-16的过表达促进IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。这些结果提示miR-16可能与OA的发展和进展密切相关。(4)SMAD7是miR-16的靶基因:使用在线软件Target Scan来搜索miR-16的内源靶基因。发现miR-16与SMAD7的3’-UTR具有一些互补碱基(图1 1),表明SMAD7可能是miR-16的靶基因。因此,构建野生型SMAD7萤光素酶载体(SMAD7-WT)和突变型SMAD7萤光素酶载体(SMAD7-MUT)并将其导入HEK293T细胞以验证miR-16与SMAD7之间的相互作用。通过在用SMAD7(WT)载体转染的HEK 293T细胞中引入miR-16模拟物,相对萤光素酶活性显著降低,而SMAD7的3’-UTR中预测的匹配位点的突变对miR-16上调后的荧光素酶活性没有影响。此外,Western印迹分析显示,miR-16过表达显著抑制SMAD7的表达,而miR-16下调显著促进IL-1β诱导的软骨细胞中的SMAD7表达(P<0.05)。通过将 SMAD7-WT 载体与 miR-NC,miR-16,miR-16+pcDNA 和 miR-16+MEG3一起转染到HEK293T细胞中,进行双荧光素酶报告基因测定。数据显示,在用SMAD7-WT载体转染的HEK 293T细胞中,miR-16过表达导致萤光素酶活性降低,通过引入MEG3显著改善(P<0.05)。另一方面,MEG3过表达显著促进SMAD7表达,MEG3低表达显著抑制SMAD7表达(P<0.05)。此外,通过在IL-1β诱导的软骨细胞中引入miR-16或抗miR-16显著逆转由MEG3或si-MEG3诱导的SMAD7的表达改变(P<0.05)。总之,我们的结果表明SMAD7是miR-16的靶基因,并且MEG3参与IL-1β诱导的软骨细胞中的miR-16/SMAD7通路。结论:(1)在大鼠OA模型的软骨组织中miR-16的表达显著增加。(2)miR-16的过表达抑制IL-1β诱导的软骨细胞的增殖。这些结果提示miR-16可能与OA的发展和进展密切相关。(3)miR-16的过表达促进IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。这些结果提示miR-16可能与OA的发展和进展密切相关。(4)通过在IL-1β诱导的软骨细胞中引入miR-16或抗miR-16显著逆转由MEG3或si-MEG3诱导的SMAD7的表达改变。结果表明SMAD7是miR-16的靶基因,并且MEG3参与IL-1β诱导的软骨细胞中的miR-16/SMAD7信号通路。第三部分 LncRNA MEG3与miR-16/SMAD7通路的相互作用研究目的:骨关节炎(OA)是一种慢性关节疾病,目前尚无明确的治疗方法。Micro-RNA已被证实在OA的发展中起重要作用。但是其具体作用机制至今尚未明确,尤其是LncRNA MEG3与miR-16/SMAD7通路的相互作用研究。方法:构建大鼠OA模型和白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的大鼠软骨细胞。并且分成 miR-NC,miR-16,anti-miR-NC 以 anti-miR-16 组。RT-qPCR 检测大鼠 OA 模型软骨组织中miR-16与MEG3的表达模式,检测软骨细胞中miR-16对软骨细胞增殖或凋亡的影响表达情况。根据细胞活力和凋亡评估miR-16与MEG3对IL-1β诱导的软骨细胞的影响。采用Western blot检测,MEG3对SMAD7表达的影响。采用荧光素酶报告反应,检测miR-16与MEG3的相互作用。采用RNA免疫共沉淀分析miR-16与MEG3的表达。结果:(1)miR-16 与 MEG3 互为 ceRNA发现miR-16与MEG3的序列具有一些互补碱基,表明miR-16可能与MEG3相互作用。为了验证MEG3和miR-16之间的结合,进行RNA免疫沉淀(RIP)测定和双荧光素酶报道基因测定。使用Ago2抗体进行RIP测定以确认MEG3和miR-16之间潜在的内源相互作用。数据显示与IL-1β诱导的软骨细胞中的阴性对照相比,MEG3和miR-16大部分被抗Ago2捕获。(2)MEG3 调节 miR-16/SMAD7 通路对于双荧光素酶报告基因检测,构建野生型(WT)和突变型(MUT)MEG3萤光素酶报道基因载体,并将其与miR-NC,miR-16模拟物,抗miR-NC或抗miR--miR-16。这些结果显示MEG3(WT)载体的萤光素酶活性分别通过用miR-16模拟物或抗miR-16转染显著降低或增强(P<0.05)。尽管MEG3报告载体中推定位点的突变对miR-16上调或miR-16下调后的荧光素酶活性影响不大。为了进一步阐明MEG3与miR-16之间的相互作用,在大鼠OA模型的软骨组织中检测到MEG3和miR-16的表达。MEG3表达与miR-16呈负相关。此外,MEG3过表达显著抑制miR-16表达,而MEG3下调显著促进miR-16的表达(P<0.05)。(3)miR-16抑制MEG3诱导的软骨细胞增殖或凋亡细胞活力检测显示,anti-miR-16的引入,si-MEG3-mediated促增殖作用明显逆转,MEG3-mediated抗增殖作用明显缓解miR-16上监管。此外,anti-miR-16的引入,si-MEG3-mediated的抗凋亡作用明显地被废除,MEG3-mediated miR-16的引入使细胞凋亡效应显著逆转(P<0.05)。结果表明,Bc12和Bax的表达变化揭示了细胞凋亡的发现。结果表明,miR-16逆转MEG3介导的在IL-1β诱导软骨细胞中的促增殖和抗凋亡作用(P<0.05)。换言之,MEG3可能通过miR-16在OA中调节软骨细胞增殖和凋亡。(4)MEG3通过调节SMAD7诱导软骨细胞增殖或凋亡在用 si-MEG3+PBS,si-MEG3+SMAD7,MEG3+PBS,MEG3+si-SMAD7 或IL-1β诱导的软骨细胞中检测到细胞增殖和凋亡相应的阴性对照。有趣的是,数据显示,在SMAD7上调之后,si-MEG3介导的抗增殖效应显著逆转,而MEG3介导的促增殖效应通过SMAD7上调而显著改善(P<0.05)。SMAD7过表达显著改善了 si-MEG3介导的促凋亡作用,并且通过引入si-SMAD7显著消除了 MEG3介导的抗凋亡(P<0.05)。此外,Western印迹分析也验证了凋亡的发现,其通过在IL-1β诱导的软骨细胞中Bcl2和Bax的表达变化显示。综上所述,这些结果表明MEG3可能通过调节SMAD7在OA中发挥其促增殖和抗凋亡作用。结论:(1)MEG3 参与 miR-16 途径,MEG3 抑制 miR-16 表达。(2)SMAD7是miR-16的靶基因,并且miR-16在IL-1β诱导的软骨细胞中抑制SMAD7表达。(3)由MEG3或si-MEG3诱导的SMAD7的表达通过引入miR-16或抗miR-16显著逆转。(4)MEG3通过调节miR-16和SMAD7发挥其促进软骨细胞增殖和抗凋亡作用。上调MEG3可能通过miR-16/SMAD7信号通路促进IL-1β诱导的大鼠软骨细胞增殖和抑制凋亡,这表明MEG3可能是OA中有用的标记物和潜在的治疗靶点。