研究背景：乳腺癌(mammary carcinoma)是女性最常见的恶性肿瘤之一。世界各国乳腺癌的发病率不尽相同,其病因尚不清楚,可能与易感基因、环境因素、生活方式等因素有关。众观全球乳腺癌发病情况,欧美国家女性是乳腺癌的高发区,其中以北美和北欧为主,而在亚洲、非洲和拉丁美洲的多数国家发病率相对较低。据美国癌症协会(American Cancer Society, ACS)公布数据显示,全世界范围内每年新增乳腺癌患者超过130万人,占新发女性癌症患者的1/3,因乳腺癌死亡人数约45.0万人,其死亡率居女性各类恶性肿瘤首位。我国女性乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%,仅次于子宫颈癌,但近年来呈逐年上升趋势,并有超过子宫颈癌的倾向,已成为威胁女性健康与生命的主要恶性疾病之一。目前,临床主要通过病理学和影像学形态变化来对乳腺癌进行评估,术后根据肿物大小、淋巴结情况、有无远处转移等情况进行TNM分期,再结合其病理类型、免疫组化情况对其疗效和预后预测。国际上应用的最广泛的乳腺癌分级方法是B-R分级,也被称为诺丁汉分级系统,该法以肿瘤细胞的形态学和细胞学特征为评价依据,将乳腺癌分为三级,分别为低、中、高三个恶性程度作为预测乳腺癌复发和死亡的重要指标。但由于分级存在主观成分,且操作繁琐,其应用有一定的局限性。因此,有必要研发一种简便、灵敏、准确的评估方法来提高和完善现有的评估系统。随着对乳腺癌研究的不断深入,人们逐渐从分子水平揭示其肿瘤进展过程,结合乳腺癌的早期诊断中分子生物学和分子流行病学等新技术,乳腺癌的研究已经从细胞水平进入到基因水平。现在利用基因芯片技术研究乳腺癌已逐步成为一种重要的方法。基因芯片(gene chin)(又称DNA芯片,生物芯片),其原型是上世纪80年代中期提来出的,其检测原理主要是杂交测序法,即利用一组已知序列的核酸探针作为模板,将待测核酸序列与之进行杂交测定的方法。具体方法是：用一组已知核酸序列的探针安放在基片表面,把用荧光标记的待测核酸序列与之进行互补杂交,然后通过扫描确定最强荧光的探针位置,得到一组和已知核酸序列完全互补的探针序列,最后根据该序列重组出靶核酸序列。目前,人们已经发现多个基因与乳腺癌预后关系密切,如HER-2、PgR、ER等。通过这些基因可以帮助临床医生更好的为患者制定个体化治疗。不过由于不同的个体乳腺癌的基因表达谱存在差异,要想准确预测乳腺癌预后,需要结合更多的与其发生、发展相关的基因综合判断。因此,以研究单个基因为目标的低通量研究方法已经被基因芯片技术高通量大规模检测的方法所取代了。据国内外多项研究表明,基因表达谱可以作为肿瘤标志物对乳腺癌预后进行预测。Zajchowsik DA等通过利用Atlas人(7740-1)和癌(7742-1)cDNA芯片分析比较了4个高浸润性和9个低浸润性乳腺癌细胞系的基因表达谱,在两种乳腺癌细胞系中发现了24个差异表达基因,并在9个已知其浸润性的乳腺癌细胞系中进行预测,其结果与已知的浸润程度一致。1999年,Lander等根据表达谱芯片筛选差异表达基因的结果选择了70个基因并制成低密度基因芯片,并成功将其应用于临床,引起了医学界的极大关注。比利时的Lacroix等也在2002年制备了含250个与乳腺癌分型和用药指导相关的低密度表达谱芯片。近年来我国学者对基因芯片在乳腺癌预后预测研究方面也取得了不少进展。叶丽虹等利用包含329个基因的芯片,对人乳腺癌细胞系MCF-7及其转移亚克隆LM-MCF-7差异表达基因进行分析,发现67个差异表达基因中有35个基因与肿瘤有关,其中有9个基因与肿瘤转移有关,有6个基因可能参与肿瘤浸润和转移的全过程。本实验拟应用基因芯片技术高通量的优势,对一个乳腺癌标本在单次实验中同时检测不同的基因表达情况,并根据已经得到的乳腺癌基因表达的情况筛选出有意义的基因组合,研制乳腺癌分子分型及用药指导基因芯片,用于检测早期乳腺癌病人针吸活检组织、液氮保存的新鲜组织样本或者负80度冰箱保存的回顾性样本,建立随访,根据患者实际有无复发情况确立早期乳腺癌个体化治疗的分子分型诊断标准,从而实现及时、高效、准确、灵敏的乳腺癌分型诊断,为病人的个体化用药提供参考和指导,提高病人的治疗效果。目的：分析相同病理类型、临床分期但预后不同的早期乳腺癌组织的差异表达基因,筛选出有意义的基因组合,寻找与乳腺癌预后相关的基因,探索可以早期预测乳腺癌预后的基因分型诊断标准。方法：(1)标本收集：全部标本收集自2007年3月至2008年6月,南方医科大学珠江医院普通外科住院行乳腺癌改良根治术患者的肿瘤组织标本。患者入院后常规行传染病感染情况检查,HIV、HBV及HCV感染者标本不采集。手术切除的乳腺肿瘤标本在离体10分钟内收集,将采集的标本分成若干块,大小均约0.5cm×0.5cm,然后放入冻存管中,做好标记后快速放入便携式液氮罐中。收集标本按先后顺序进行标号、记录时间、填写年龄、住院号等一般项目,术后跟进常规病理结果并予记录。本研究获得南方医科大学珠江医院伦理委员会批准,所有标本收集均征得患者本人同意。(2)芯片制备：基因表达芯片由生物芯片上海国家工程研究中心制备(上海伯豪生物科技有限公司),采用Agilent定制人8×15000芯片,单张基因芯片可同时检测8个样本,每个样本可以检测15000个基因,具有独特的喷墨原位合成技术探针长度60mer, Human Genome Whole(人全基因组)。设计该产品所用的序列信息源于对RefSeq、Goldenpath、Ensembl和Unigene等知名数据库的深入研究,并与人类基因组拼接进行比对。绝大多数探针经过Agilent专利的实验验证程序的检验和优化。(3)样本基因筛选：提取乳腺癌样本中总RNA,使用QIAGEN RNeasy MiniKit纯化总RNA,利用反转录法合成cDNA并纯化,合成cRNA用aaUTP进行标记并纯化,检测其浓度及质量合格后和芯片杂交,利用Agilent扫描仪扫描并分析结果。(4)统计学方法：实验组共有8例乳腺癌标本,包括4例预后好标本和4例预后差标本,差异表达基因的筛选标准为至少在2对以上预后好与预后差标本中有2.0倍(Fold Change≥2)以上相同表达趋势的基因。基因芯片实验结果按照Ratio≥1.4或≤0.7倍为标准,筛选出预后差与预后好之间差异表达的基因,应用SPSS13.0统计软件处理数据,组间进行t-test分析。(5)Real-timePCR分析验证：将芯片结果中差异表达基因进行SYBR GREEN I real—time PCR(7900HT Fast Real-Time PCR system, Applied Biosystems)验证。以TFRC和GAPDH作为内参基因,同时进行real-time PCR检测。Real-timePCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。采用比较阈值法对real-time PCR结果进行分析。结果：1、Agilent定制基因芯片检测实验组4例乳腺癌预后差与4例预后好组织间差异表达的基因,进行基因表达芯片分析,结果发现预后差比预后好有44条基因显著上调,88条基因显著下调(fac≥2, P-value<0.01)。两组差异表达基因Pathway富集功能分析的差异基因主要集中在细胞循环、P53信号传导通路、氨基酸代谢、ECM受体相互作用等方面,差异表达基因最集中的pathway是细胞循环。2、两组差异表达基因中,实验组中预后差比预后好表达升高且差异倍数在3倍以上的基因共有10个；预后差比预后好表达降低且差异倍数在3倍以上的基因中共有19个。3、根据筛选出的差异表达基因,使用Real-time PCR验证后续收集的24例预后好乳腺癌组织样本与18例预后差乳腺癌组织样本中基因表达水平；取表达相对定量的平均值,相对预后差标本做标准化处理后作柱状图分析。验证结果表明,24例预后好乳腺癌样本中CD44、CCNB2、NEK2、BRCA1、RRM2、c16orf60等表达水平较18例预后差乳腺癌样本明显降低,MKI67、TRK2、TOP2A、ANCCA等表达水平明显升高。结论：预后好与预后差乳腺癌组织中存在表达差异显著的基因,可以从中筛选出CD44、MKI67、TRK2、NTRK2、Nek2、cl6orf60、BRCA1、TOP2A、ANCCA、RRM2等基因作为早期乳腺癌预后预测的分子标记物。