【摘 要】
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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌,是一种常见的食源性致病细菌,致病力强,会对免疫力低下的人群如幼儿、孕妇、老人等群体的身体健康造成致命威胁,综合致死率25%～30%,是世界各国重点监控的食源性致病菌之一。单增李斯特菌现有检测方法非常多样,其中核酸检测具有低成本、高灵敏度、快速、高通量等特点,应用非常广泛。单增李斯特菌分型领域最常用的是血清分型方案
【基金项目】
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基于组学的食源性致病微生物快速高通量检测技术与装备研发项目（2017YFC1601203）
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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌,是一种常见的食源性致病细菌,致病力强,会对免疫力低下的人群如幼儿、孕妇、老人等群体的身体健康造成致命威胁,综合致死率25%～30%,是世界各国重点监控的食源性致病菌之一。单增李斯特菌现有检测方法非常多样,其中核酸检测具有低成本、高灵敏度、快速、高通量等特点,应用非常广泛。单增李斯特菌分型领域最常用的是血清分型方案,包括系谱型Ⅰ（1/2b,3b,7,4b,4d,4e）、系谱型Ⅱ（1/2a,3a,1/2c,3c）、系谱型Ⅲ（4a,4c）,其中1/2a、1/2b、1/2c、4b是最主要的四种血清型（占95%以上）,将四种主要血清型区分开是分型的主要目的。现阶段通用的方法是将不同血清型的特异性基因组合使用,建立多重聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）实现对四种主要血清型的区分。随着食品流通速度加快,快速即时检出方法对防止该菌的传播意义重大,同时关于该菌分型的研究对该菌的溯源、定位传染源至关重要,本课题围绕该菌的分型和检测方法开展研究工作。本论文开发了一种普遍适用的从基因组数据库挖掘特异性单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）的方法,并运用于单增李斯特菌特异性SNP挖掘,通过对253个已知血清型的基因组比较分析,发现单增李斯特菌的基因组中含有大量的特异性SNP,筛选到1/2a-3a、1/2b-3b-7、1/2c-3c、系谱型Ⅰ、系谱型Ⅱ、系谱型Ⅲ六种类型的特异性SNP。同时分析了多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）方案中七个管家基因的SNP分布情况,找到系谱型Ⅰ、系谱型Ⅱ、系谱型Ⅲ、1/2c-3c、1/2b-7型五种类型的特异性SNP,从而将ST型和血清型建立联系,探讨了鉴定ST型的同时鉴定血清型的可能性。为了建立区分四种主要血清型的方法,筛选了大量含有特异性SNP的基因,发现lmo1441中含有多个高度保守且特异的系谱型Ⅰ和系谱型Ⅱ特异性SNP,lmo1076中含有多个高度保守且特异的1/2c-3c型和1/2b-3b-7型特异性SNP。以这两个基因为扩增对象,各设计两条特异性引物以及一条通用引物,以单个基因区分两种类型,再引入阳性控制靶点prf A建立多重PCR,开发了一种等位基因特异性多重PCR方法,实现了仅以8条引物对单增李斯特菌四种主要血清型的区分。与现行通用的血清分型方法以60株食源性样本进行分型结果比对,显示一致率100%。然后对253个单增李斯特菌基因组和540个非单增李斯特菌物种的基因组进行比对,获得8个单增李斯特菌特异性基因,以单增李斯特菌的新靶点lmo2733建立PCR检测方法,以9株非单增李斯特菌和10株单增李斯特菌证实该靶点的特异性和可靠性。并以该靶点建立了环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,通过在反应体系中添加羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue,HNB）实现检测结果的肉眼可视化,阳性样本反应后呈天蓝色,阴性样本反应后维持紫罗兰色,检测限为2 pg的基因组DNA。本课题围绕单增李斯特菌的血清分型和检测进行系统研究,开发了挖掘特异性SNP的方法同时基于SNP实现对单增李斯特菌四种主要血清型的区分,该方法不同于主流的基因分型方法,普适性强,可应用于其他物种分型。本研究筛选到单增李斯特菌的新检测靶点lmo2733,基于该靶点建立了LAMP结合HNB的肉眼可视化检测方法,该方法经济高效,具有潜在的应用价值。
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