棉花具有复杂的分枝模式,包括叶枝和果枝。由于叶枝对主茎及果枝生长存在抑制效应,且叶枝结铃率和铃重较低,纤维品质较差。因此,人工去叶枝一直作为我国棉花精耕细作栽培管理技术的重要内容。进入新时代,随着社会经济发展和农村劳动力向城市转移,人工去叶枝等农艺措施难以实行,探索人工整枝的替代措施势在必行。研究和实践皆发现,提高密度(密植)显著抑制棉花叶枝生长发育,可以替代人工去叶枝,但迄今对其机理尚不明确。棉花叶枝生长发育受多种因素的影响和调控,其中,环境变化会引起激素合成代谢相关基因的差异表达及激素含量的改变,从而影响叶枝生长。NAC基因转录因子家族作为植物所特有,参与调控植物器官发生与分枝、逆境胁迫响应等过程,在水稻及拟南芥中过表达NAC基因显著影响植株的分蘖或分枝。因此,深入研究密度对棉花叶枝生长发育的调控机理以及MAC基因的功能,对有效调控叶枝发育具有重要意义。为此,本文开展了以下3个方面的试验研究:一是密度试验。于2015～2016年在大田设置低、中、高(分别为3、6、9万株/hm2)三种密度处理,比较研究了不同密度棉花叶枝生长发育和结铃状况,以确定不同种植密度对棉花叶枝生长发育的效应;对不同密度下棉花主茎叶和叶枝叶的光合作用,主茎顶和叶枝顶激素合成代谢相关基因表达与激素含量变化进行了测定分析,以揭示密度调控叶枝生长发育的机制。二是遮荫试验。由于密度增加引起的遮荫主要发生在棉株下部,因此2017～2018年在大田条件下蕾期通过遮阳网对叶枝进行遮荫,研究了叶枝遮荫对叶枝生长、叶片光合、激素合成代谢相关基因表达和激素含量变化的效应,探究叶枝遮荫是否通过与密植相同(似)的机制抑制叶枝生长,以进一步揭示密植调控叶枝生长的机制。三是GhNAC4功能研究。利用该基因的特异性引物和聚合酶链式反应技术从棉花叶片中克隆得到GhNAC4基因。通过VIGS技术在棉花中瞬时沉默GhNAC4基因,并在陆地棉及拟南芥中过表达,探究GhNAC4基因在调控植物分枝以及抗逆中的功能。主要结果和结论如下:1.高密度通过相互遮荫减少叶枝叶光合作用阻碍光合产物积累,同时抑制光信号受体phyB基因表达,改变下游激素合成转运相关基因的表达和激素含量抑制棉花叶枝生长(1)高密度显著抑制叶枝生长。高密度下叶枝干重与总干重的比值及叶枝数目均显著低于低密度处理。其中,在播种后125 d,与低密度相比,高密度棉花叶枝干重与总干重的比值降低了95.0%,叶枝数目减少了67.3%。(2)高密度显著降低棉花叶枝叶光合作用。在播种后1 10和125 d,与低密度相比,高密度棉花叶枝叶净光合速率(Pn)分别降低76.4%和83.7%;RuBP羧化酶活性分别降低28.1%和33.2%;叶绿素含量分别减少62.8%和68.6%;可溶性糖含量分别减少25.8%和26.4%;淀粉含量分别减少44.4%和40.0%。(3)高密度改变棉花主茎顶激素合成、转运相关基因的表达和激素含量,同时通过抑制叶枝顶光受体phyB基因的表达,抑制下游激素合成、转运相关基因的表达及其激素含量。密度增加提高了棉花主茎顶生长素合成、转运及细胞分裂素合成关键基因的表达及其相应的激素含量。在播种后110和125 d,与低密度相比,高密度主茎顶生长素合成关键基因GhYUC5表达量分别增加62.5%和43.7%,生长素转运基因GhPIN1表达量分别增加34.1%和21.5%,细胞分裂素合成关键基因GhIPT3表达量分别增加79.7%和82.9%;相应的生长素含量分别增加43.9%和3 1.3%,细胞分裂素含量分别增加29.7%和38.6%。与主茎顶不同,密度增加抑制编码光信号受体基因phyB的表达,抑制下游生长素、细胞分裂素合成转运关键基因的表达及其相应激素含量,同时促进编码独脚金内酯受体D14基因及独脚金内酯含量抑制叶枝生长,其中,在播种后1 10和125 d,与低密度相比,高密度棉花叶枝顶GhphyB基因的表达量分别降低52.3%和62.3%;生长素合成关键基因GhYUC5表达量分别降低65.8%和57.0%,生长素转运基因GhPIN1的表达量分别降低61.4%和60.6%,GhPIN 的表达量分别降低86.1%和72.7%,细胞分裂素合成关键基因GhIPT3的表达量分别降低63.8%和66.8%,而编码独脚金内酯受体的基因GhD14的表达量分别增加57.1%和57.8%。同时,密度增加抑制糖合成关键基因GhCYFBP的表达,在播种后125 d,与低密度相比,高密度叶枝顶GhCYFBP基因的表达量减少了67.3%。与相关基因表达相对应,叶枝顶生长素含量分别减少45.3%和27.9%,细胞分裂素含量分别减少38.3%和25.7%,赤霉素含量分别减少23.1%和38.2%;油菜素内酯含量分别减少28.8%和21.5%;而独脚金内酯含量分别增加25.3%和31.2%。2.叶枝遮荫显著降低叶枝光合生产,通过抑制光敏色素受体基因phyB的表达,改变下游激素合成转运相关基因表达及其激素含量,通过与密植基本相同的机制抑制叶枝生长(1)遮荫显著抑制叶枝生长。在播种后55、62和69 d,与对照相比,遮荫棉花叶枝数目分别减少54.2%、53.6%和56.2%;叶枝长度分别减少40.8%、75.8%和88.8%;叶枝干重与总干重比值分别降低94.9%、89.7%和91.3%;而果枝干物重分别增加了2.0%、1 8.5%和30.8%。(2)遮荫降低棉花叶枝叶光合作用。在播种后55、62和69 d,与对照相比,遮荫棉花叶枝叶净光合速率(Pn)分别降低了42.7%、86.3%和96.4%;RuBP羧化酶的活性分别降低了 23.7%、29.1%和28.0%;叶绿素含量分别减少46.7%、44.1%和82.0%;可溶性糖含量分别减少74.3%、48.9%和51.7%;淀粉含量分别减少80.0%、58.7%和86.0%。而叶枝遮荫显著促进棉花主茎叶光合产物积累,与对照相比,在播种后55、62和69 d,主茎叶净光合速率(Pn)分别增加12.2%、15.1%和12.2%;RuBP竣化酶的活性分别增加13.2%、5.4%和9.8%;叶绿素含量分别增加10.0%、16.2%和18.4%;可溶性糖含量分别增加21.1%、19.2%和22.5%;淀粉含量分别增加12.3%、37.4%和38.1%。(3)遮荫通过减少棉花叶枝顶光受体phyB改变下游激素合成、转运相关基因的表达及其相应的激素含量。在播种后55、62和69 d,与对照相比,遮荫叶枝顶编码光敏色素B蛋白的基因GhpyB的表达量减少了 26.5%、32.7%和56.1%;生长素合成关键基因GhYUC5表达量分别减少79.1%、86.4%和91.2%;生长素转运基因GhPIN1的表达量分别减少55.5%、76.1%和81.9%;GhPIN5的表达量分别减少23.6%、77.1%和82.2%;细胞分裂素合成关键基因GhIPT3的表达量分别减少41.5%、94.2%和92.9%;而编码独脚金内酯受体的基因GhDI4的表达量分别增加111.7%、32.7%和56.1%,同时,遮荫抑制糖合成关键基因GhCYFBP的表达,在播种后55、62和69 d,与对照相比,遮荫后叶枝顶GhCYFBP基因的表达量减少了 87.7%、88.6%和96.3%。与相关激素合成、转运相关基因的表达量相对应,遮荫棉花叶枝顶生长素、细胞分裂素和油菜素内酯的含量显著降低,在播种后55、62和69 d,与对照相比,遮荫棉花叶枝顶生长素的含量分别减少33.8%、19.7%和40.8%;细胞分裂素含量分别减少19.3%、12.6%和24.1%;油菜素内酯的含量分别减少24.6%、26.2%和27.8%;而独脚金内酯的含量分别增加21.5%、30.5%和28.6%。3.棉花GhNAC4虽然不直接参与调控拟南芥分枝,但正向调控棉花的抗旱耐盐性和负调控叶片衰老(1)通过Blastp同源比对分析不同物种的NAC2蛋白氨基酸序列发现,GhNAC4基因的编码区全长为1041 bp,且该基因编码的蛋白与拟南芥AtNAC2蛋白序列的相似度高达79.2%。(2)在野生型拟南芥中过表达棉花GhNAC4基因,并对稳定遗传的阳性纯合株系进行表型分析发现,与野生型相比,GhNAC4基因过表达后拟南芥的分枝数目及抽薹时间没有差异,且GUS染色结果显示该基因启动子在植株分生组织内没有表达,说明GhNAC4基因不能直接调控拟南芥分枝的生长发育。但正常生长3个月后转基因植株莲座叶的衰老延缓,同时植株对盐、旱逆境胁迫的抗性显著增强,说明GhNAC4基因可能参与调控拟南芥叶片衰老及植株对逆境胁迫的响应。GUS染色结果表明,GhNAC4基因启动子的表达活性受到盐和干旱的诱导,说明该基因启动子为胁迫诱导型启动子;观察GhNAC4蛋白在洋葱表皮细胞内的亚细胞定位发现,GhNAC4蛋白在植物细胞的细胞核上。(3)在棉花内分析GhNAC4基因在不同逆境胁迫诱导下的表达水平。qRT-PCR结果表明,棉花叶片和根中GhNAC4基因的表达水平不仅受到盐、干旱逆境胁迫的影响,同时还受H2O2和ABA等耐逆信号的诱导,说明GhNAC4基因在调控植物对不同逆境胁迫响应过程中具有重要地位。(4)利用VIGS技术在棉花中沉默GhNAC4基因后发现,植株抗旱耐盐性显著降低。GhNAC4基因沉默增加VIGS棉花对盐和干旱胁迫的敏感性,说明GhNAC4基因在调控棉花耐逆抗旱性中起正向调控作用。总之,本文探究了密植对棉花叶枝生长发育的抑制效应,揭示了其生理及分子机制,并通过叶枝遮荫发现遮荫通过与密植相似的机制抑制叶枝生长,进一步证实基部光照不足是密植抑制叶枝生长的主要生态因子。虽然NAC基因调控水稻及拟南芥植株的分蘖或分枝,但未见源于棉花的GhNAC4基因直接参与植物分枝调控,不过发现GhNAC4基因负调控植物衰老并正向调控抗旱耐盐性。本研究为有效控制叶枝生长提供了重要依据和参考。