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秸秆等有机农业废弃物主要成分是木质素、纤维素和半纤维素,利用秸秆的关键就是降解包裹在纤维素和半纤维素外面的木质素。漆酶(EC 1.10.3.2)底物范围十分广泛,可以催化酚类、芳胺类和木质素等化合物,在环境治理、食品工业和木质素降解等方面都有广阔的应用前景。漆酶的生产主要来源于微生物发酵,但其发酵周期长,酶稳定性差,因此,本研究通过基因工程的手段进行漆酶基因的克隆,并进行异源表达来提高酶活力及产量,增加酶的稳定性主要研究结果如下：从土壤及腐败树木上分离到16株产漆酶细菌和6株产漆酶真菌,通过比较酶活力,确定1株漆酶活力较高的细菌QM11和1株漆酶活力较高的真菌Z6,在产酶培养基中酶活力分别达到了4.36 U/L和62.78 U/mL。根据形态学观察、生理生化鉴定和细菌16S rDNA保守区的基因测序分析,初步鉴定QM11细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。根据形态学观察,真菌ITS-rDNA保守区的基因测序分析,初步鉴定Z6真菌为变色栓菌(Trametes versicolor)。通过特异性引物进行QM11菌株及Z6菌株漆酶基因的克隆,得到细菌漆酶cotA基因长度为1542 bp,编码513个氨基酸,cotA蛋白相对分子量约为58 kDa,理论等电点为5.91。真菌漆酶lac1基因长度为1560 bp,编码519个氨基酸,lacl蛋白相对分子量为56 kDa,理论等电点为5.87。将变色栓菌Z6的漆酶lacl基因构建真核表达载体pPIC9K-lac1,并转化至毕赤酵母中,构建重组表达菌株P. pastoris GS115/pPIC9K-lac1,随后进行重组菌株的诱导表达,结果在BMMY培养基诱导72 h后出现酶活,最高达到了5.44 U/L。将枯草芽孢杆菌QM11的漆酶cotA基因构建原核表达载体pET22b-cotA,并转化至大肠杆菌中,构建重组表达菌株E.coli BL21/pET22b-cotA,并在16℃进行诱导表达,经SDS-PAGE检测结果显示实际分子量为70 kDa左右。随后将cotA蛋白通过Ni-NTA进行纯化,纯化后的重组cotA蛋白的比活力为136.73 U/mg,纯化倍数为7.83倍,回收率为40.29%。对纯化后的cotA蛋白进行酶学性质的研究,乡结果显示重组cotA蛋白的最适pH值为3,在pH 2-4的范围内稳定性较好,剩余酶活力均达到70%以上。重组cotA蛋白的最适温度为70℃,在60℃-80℃范围内热稳定性良好,80℃处理1h后仍有40%左右的酶活力。在每种离子浓度为1 mmol/L的环境中,Fe3+及Cu2+可显著提高重组cotA蛋白活性,分别提高了2.7倍和4.5倍,Fe2+强烈抑制cotA蛋白的活性,使cotA蛋白活性只有初始活力的17.26%,Ca2+及C02+对重组cotA蛋白的活性几乎无影响。以2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)为底物对重组cotA的动力学常数进行测定,经过计算得到Km=0.48 mmo1-L-1,Vmax=0.448 mmol·L-1·min-1。