研究目的基因表达是一个复杂而精细的网络调控过程,细胞的生物学功能是在特定时间和空间里,多种基因表达及相互调控的结果。明确细胞在生理与病理条件下的基因表达及其调控的差异,将对细胞生理与病理状态的干预提供极大帮助。随着测序技术和基因组学的不断发展,越来越多的高通量基因筛选技术应运而生。相比之下,基因表达序列分析技术(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)技术可以将细胞在特定功能状态下全转录组中每一条mRNA转化为最简单的10bp的标签形式,并通过后续的一系列操作对标签进行定性定量,具有高通量、高敏感性、可定量和可以发现新基因的优点,已被广泛用于特定细胞在特定功能状态下的转录组研究。因此,阐明应用SAGE技术进行疾病基因组研究时的优势和问题,将对未来选择SAGE技术进行疾病研究具有指导意义。同种移植排斥是器官移植失败的主要原因,而CD4+T细胞在这一过程中具有重要作用。随着对不同亚群CD4+T细胞在同种移植排斥或耐受过程中作用研究的不断深入,发现单一研究某种基因或目前已知的某类分子已经很难解释各CD4+T细胞亚型间复杂的相互作用及它们在移植中的行为方式。非常有必要在基因组水平研究它们彼此之间基因表达的差异,及其在移植排斥和耐受中基因表达的特点,因此,在基因组水平发现更多CD4+T细胞特异的移植相关基因将对分析不同CD4+T细胞亚型在移植过程中的作用和相互调节具有重要意义。因此,本研究第一部分选择构建同种移植排斥相关CD4+T细胞SAGE文库,并通过该文库的构建分析应用SAGE技术进行疾病差异表达基因研究时所应注意的问题。尽管SAGE技术已被广泛用于基因组结构和功能的研究。但是,由于SAGE技术本身的原因所造成的SAGE标签基因匹配的低特异性使得对标签的基因确定成为SAGE研究的最大难题。尽管后来出现的结合标签的基因序列延伸技术(Generation of Longer cDNA Fragments from SAGE Tags for Gene Identification,GLGI)将SAGE标签转化为较长的3’EST片段用于cDNA模板的确定,但结果仍不理想。且这两种技术的操作流程非常复杂,不适合用于大规模样本,如肿瘤样本的研究。因此需要进一步探讨高通量基因筛选的新技术,为在基因组水平深入研究疾病基因奠定实验基础。随着下一代测序(Next-Generation Sequencing)技术的出现,已经涌现出一些新的基因组学研究技术,如双标签基因组扫描(Ditags Genome Scanning, DGS)技术,它可以较准确的在kb分辨率水平发现正常群体基因组的相似性和差异性,确定病理情况下,如肿瘤基因组的插入、转位、缺失、易位等异常。然而,其复杂的操作流程却严重的限制了它在大规模疾病基因组研究中的应用。因此,需要以新的测序仪为平台,对DGS技术进行改良。课题的第二部分即对原有DGS技术进行改良,相继建立了改良的体内DGS技术和简化的体外DGS技术,旨在为疾病基因组的大规模研究提供新的高通量基因筛选工具。然而,尽管简化的体外DGS技术在实验流程和基因组检测效率上有了很大程度的提高,但16bp的可选序列有时无法提供较好的引物设计参考区域,因而可能影响对目的基因进行PCR扩增的效率和特异性。为此,论文的第三部分建立了限制性片段全基因组扫描技术,它是在下一代测序平台的测序能力进一步提高的基础上产生的,旨在更好的发挥DGS技术等末端配对测序技术的优点并进一步简化样本制作过程,使得大规模基因组测序更为常规化。研究方法第一部分同种移植排斥CD4+T细胞SAGE文库的构建及分析本研究应用SAGE技术建立同种移植及同系移植组CD4+T细胞mRNA标签库。通过统计学分析确定CD4+T细胞同种移植排斥相关低拷贝标签,并通过NCBI SAGEmap可信数据库比对和GLGI技术进一步确定同种移植CD4+T细胞相关基因。通过实时定量RT-PCR扩增部分显著差异标签,比较两种方法在发现差异表达基因方面的敏感性。通过与cDNA微阵列研究结果的比较,分析SAGE技术与cDNA微阵列技术的差异和互补性。第二部分DGS技术的优化及应用本研究对原有DGS技术进行改良,相继建立了改良的体内DGS技术和简化的体外DGS技术。改良的体内DGS技术对原DGS流程中后两步的质粒文库构建进行改进,分别是：1、应用MHM pZErO-1质粒上的M13引物位点PCR释放ditags取代原方法中ditags质粒扩增后酶切释放ditags。2、用Solexa测序仪直接测序ditags取代原方法中质粒扩增454测序连接体的步骤。简化的体外DGS技术则设计了PstI-Mmel-Solexa adaptor,用adaptor与基因组片段的体外连接取代了原DGS技术中三步质粒文库构建过程,通过白血病细胞系Kasumi-1基因组DNA检测该技术的可行性,并成功应用简化的体外DGS技术制备了8个家族性乳腺癌患者基因组PstI ditags文库。第三部分限制性片段全基因组扫描技术的建立及其应用计算机模拟分析130种限制性酶切位点在人类HG18参考基因组中的分布特点及限制性片段测序全基因组扫描技术的可行性。应用用FatI(/CATG)和Tsp509I(/AATT)相继酶切基因组DNA制备CATG-AATT限制性片段。用T4 DNA聚合酶补平酶切产生的5’凸出粘性末端。应用无3’→5’外切酶活性的Klenow片段限制性片段3’末端加“A”。与3’末端含有“T”的Solexa adaptors连接。琼脂糖凝胶电泳纯化连接产物,去掉adaptor自身二聚体。PCR扩增adaptor-DNA-adaptor片段。利用adaptor上的测序引物进行Solexa测序,每段片段读取两端各35～75bp序列。结果第一部分同种移植排斥CD4+T细胞SAGE文库的构建及分析共得到同种移植组51808个和同系移植组51644个标签序列,分别代表同种移植组13726个和同系移植组13386个独特转录本。统计分析确定402个(拷贝数均<50)明显差异表达(p