【摘 要】
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农药创新对于虫害防治至关重要,现有的化学农药面临着产生抗药性快、人畜毒性大等一系列问题,究其根源在于靶标种类单一,因此农药创新的关键在于靶标创新。昆虫的生长发育伴随着周期性的几丁质重塑过程,对昆虫几丁质代谢系统中的关键酶进行干扰被认为是虫害防治的有效手段之一。在昆虫体内,参与表皮几丁质降解的关键酶主要为糖基水解酶18家族几丁质酶,包括几丁质酶Ⅰ号酶（ChtI）、几丁质酶Ⅱ号酶（ChtⅡ）和几丁质酶
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农药创新对于虫害防治至关重要,现有的化学农药面临着产生抗药性快、人畜毒性大等一系列问题,究其根源在于靶标种类单一,因此农药创新的关键在于靶标创新。昆虫的生长发育伴随着周期性的几丁质重塑过程,对昆虫几丁质代谢系统中的关键酶进行干扰被认为是虫害防治的有效手段之一。在昆虫体内,参与表皮几丁质降解的关键酶主要为糖基水解酶18家族几丁质酶,包括几丁质酶Ⅰ号酶（ChtI）、几丁质酶Ⅱ号酶（ChtⅡ）和几丁质酶h（Chi-h）。ChtI和ChtⅡ在不同昆虫间高度保守,而Chi-h则具有种属特异性,只保守性地存在于鳞翅目昆虫体内。鳞翅目昆虫是农业害虫的最大来源,Chi-h的功能缺失可导致鳞翅目昆虫因蜕皮异常而死亡。鉴于Chi-h对鳞翅目昆虫生长发育的重要性,其可作为开发特异性靶向鳞翅目昆虫的绿色农药的潜在靶标。目前对Chi-h的结构与功能关系还知之甚少,这很大程度上制约了 Chi-h的抑制剂开发。本论文以鳞翅目害虫亚洲玉米螟来源的几丁质酶OfChi-h为研究对象,结合结构生物学和生化性质研究揭示了 OfChi-h的结构与功能关系并开发了一系列靶向OfChi-h的小分子抑制剂,主要研究结果如下:1.OfChi-h的结构与功能关系底物水解活性分析揭示了 OfChi-h的底物特异性,其倾向于水解高晶态底物;水解模式分析表明OfChi-h具有从几丁质链还原端进程性水解底物的外切酶活性;在水解生理底物昆虫表皮几丁质时,OfChi-h与OfChtI表现出显著的协同效应。根据OfChi-h的晶体结构可知OfChi-h主要由几丁质催化域和几丁质结合域组成。催化域为典型的（β/α）8折叠桶结构,含有几丁质插入结构域（CID）,CID的存在增加了底物结合裂缝的深度,有利于底物结合。几丁质结合域位于蛋白序列的N端,表面分布有可能参与底物结合的芳香族氨基酸。根据OfChi-h与底物类似物（GlcN）7的复合物晶体结构可知,OfChi-h的底物结合裂缝是狭长且两端开放的,其中排列有9个芳香族氨基酸,这些氨基酸在催化中心两侧呈非对称分布,可通过与底物糖环形成疏水堆积作用介导OfChi-h与底物的结合。此外在底物结合裂缝附近还存在两段额外的α螺旋结构,该结构的存在使得结合裂缝更为狭窄,从而增强OfChi-h与几丁质链的结合能力,提高其对晶态底物的水解活性。2.OfChi-h的小分子抑制剂（1）小檗碱及其衍生物小檗碱是GH18家族几丁质酶的广谱抑制剂,对OfChi-h也表现出一定的抑制效果,复合物晶体结构显示其与几丁质酶的结合主要由共轭四联环平面和保守芳香族氨基酸之间的π-π堆积作用所介导。在保留小檗碱母体结构的基础上对其9-O位点进行衍生化从而增强化合物与几丁质酶的亲和力将显著提高小檗碱衍生物对OfChi-h的抑制活性和选择性,其中6-氟代烟酰碱基团取代的化合物4c对OfChi-h的抑制活性最高,抑制常数Ki为80nM。（2）底物类似物底物类似物TMG-（G1cNAc）2/4是OfChi-h的选择性抑制剂,其中TMG-（GlcNAc）4对亚洲玉米螟幼虫表现出较好的体内活性。水解产物分析显示TMG-（GlcNAc）4可被进一步水解生成TMG-（GlcNAc）2,因此推测TMG-（GlcNAc）2是OfChi-h的稳定抑制剂。（3）微生物次级代谢产物phlegmacin Bi微生物次级代谢产物phlegamcin B1是GH18家族几丁质酶OfChi-h和GH20家族N-乙酰己糖氨酶OfHex1的双靶点抑制剂,抑制常数Ki分别为5.5 μM和26 μM。分子对接和动力学模拟揭示phlegmacin B1与酶的结合主要通过疏水堆积和氢键相互作用实现。体内活性评价显示phlegamcin B1可导致亚洲玉米螟幼虫蜕皮异常而死亡,因此可作为绿色农药开发的潜在先导化合物。综上,本论文揭示了几丁质酶OfChi-h的结构与功能关系,加深了对昆虫表皮几丁质降解系统的认识;同时获得了一系列针对OfChi-h的小分子抑制剂,为绿色农药的开发提供了新的骨架化合物。上述工作对于昆虫介导的疾病控制和农业虫害防治具有现实意义。
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