DADS作用HL-60细胞后对细胞凋亡和周期相关基因表达的影响

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第一部分DADS诱导HL-60细胞增殖抑制和凋亡作用目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)对人白血病细胞HL-60的增殖、凋亡及其周期分布的影响。方法:通过绘制不同浓度DADS作用后HL-60细胞生长曲线和计算细胞群体倍增时间,研究DADS对HL-60细胞增殖抑制作用,并利用流式细胞仪检测细胞周期分布。采用形态学观察、PI单染和AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术以及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法来证实细胞凋亡。结果:(1)生长曲线表明,60μmol·L-1和120μmol·L-1 DADS对HL-60细胞增殖抑制作用明显(P<0.05)。(2)常规培养的HL-60细胞群体倍增时间为18.45h,60μmol·L-1和120μmol·L-1DADS作用后细胞群体倍增时间分别延长至30.95h和60.70h(P<0.05)。(3) DADS抑制HL-60细胞增殖与周期阻滞有关,15μmol·L-1和30μmol·L-1 DADS主要将HL-60细胞阻滞于S期和G2/M期,60μmol·L-1和120μmol·L-1 DADS主要将HL-60细胞阻滞于G1期(P<0.05)。(4) PI单染流式细胞术显示,15、30、60μmol·L-1 DADS作用HL-60细胞24h后,细胞凋亡率分别为(3.45±0.35)%、(10.90±0.85)%、(33.25±1.63)%,呈浓度依赖性增加(P<0.05)。(5) AnnexinⅤ/ PI双染法显示,60μmol·L-1 DADS作用4、8、12h后,细胞凋亡率分别为(4.60±0.45)%、(8.51±0.45)%、(16.92±0.77)%,具有明显的时间依赖性(P<0.05)。(6) 60μmol·L-1 DADS作用24h后,DNA琼脂糖凝胶电泳可见特征性的阶梯状条带,光学显微镜观察到细胞体积缩小,核浓缩和凋亡小体形成等典型的形态学改变。结论:1. DADS可明显抑制HL-60细胞增殖,并与细胞周期阻滞有关。2. 60μmol·L-1 DADS能够有效诱导HL-60细胞凋亡。第二部分DADS作用HL-60细胞后相关基因表达谱分析目的:应用基因芯片技术获得DADS作用HL-60细胞后相关基因的表达谱,筛选出差异表达基因。从基因水平探讨DADS对HL-60细胞的作用机制。方法:提取60μmol·L-1DADS作用4h后的HL-60细胞和未处理HL-60细胞中的RNA,反转录成cDNA后进行生物素标记,与Superarray公司的含有288个基因的人细胞凋亡和周期基因芯片杂交,GEArray软件对结果进行分析,筛选出DADS作用后差异表达显著的基因,并采用RT-PCR和Western blot技术验证芯片结果可靠性。结果:(1)基因芯片检测发现,DADS作用后有6个基因表达显著上调,包括:Fas-L、TRAF1、TRAF5、E2F6、IL8和CXCL10;22个基因表达显著下调,包括:Bag-1、BNIP3、MCL-1、TNFRSF10C、TNFRSF8、Cyclin B、Cyclin C、Cks1p9、CUL4A、E2F-4、Hus1、MCM2、MKI67、MRE11B、NEDD8、PCNA、SKP1A、GPX1、CAT、DNAJA1、HSPA4和HSPA9B。(2) RT-PCR和Western blot验证结果表明,60μmol·L-1 DADS作用后Fas-L表达增强,Bag-1表达减弱,与芯片结果一致。结论:1. DADS可能通过下调MCM2、MKI67和PCNA抑制HL-60细胞增殖。2. DADS可能通过下调CyclinB1、CKS1B、CUL4A、NEDD8、SKP1A诱导HL-60细胞周期阻滞。3. DADS可能通过上调Fas-L,下调Bag-1、MCL1、TNFRSF8和TNFRSF10C诱导HL-60细胞凋亡,这可能是包括死亡受体途径和线粒体途径在内的多条通路共同作用的结果。
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