【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种病毒性疾病,可感染所有年龄的猪,引发呼吸道及生殖道疾病。PRRSV为RNA病毒,极易发生重组变异产生新的病毒株,2006年我国暴发高致病性PRRSV,短时间内造成巨大经济损失。2013年以来我国部分省份出现一种新的PRRSV类NADC30变异毒株（NL-
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猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是一种病毒性疾病,可感染所有年龄的猪,引发呼吸道及生殖道疾病。PRRSV为RNA病毒,极易发生重组变异产生新的病毒株,2006年我国暴发高致病性PRRSV,短时间内造成巨大经济损失。2013年以来我国部分省份出现一种新的PRRSV类NADC30变异毒株（NL-PRRSV）,并且逐渐成为我国主要流行毒株。病毒抗原性和致病性出现明显变化,给该病防控带来更大困难。同时,PRRSV抗体检测主要依赖N蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒,不能有效衡量感染猪群免疫保护水平,无法用于GP5亚单位疫苗免疫效力评价。GP5蛋白是PRRSV最主要的保护性抗原蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,与猪体抵抗PRRSV的关系更加密切。本研究采用NL-PRRSV分离毒株FJ1402在Marc-145细胞上连续传代至60代,证明其对仔猪致病性逐渐降低。建立的GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法具有较高特异性和敏感性,具有较好应用前景。具体内容如下:1.PRRSV类NADC30 FJ1402分离毒株毒力稳定性研究本研究将NL-PRRSV FJ1402分离毒株在Marc-145上进行连续传代至60代,选择F5、F30、F60代次病毒进行滴度测定,病毒滴度为105.5、105.5和106.5 TCID50/mL。选择20头30～35日龄PRRSV和PCV2阴性健康仔猪,随机分为4组,第1-3组分别肌肉注射相同剂量（106.0 TCID50/mL）的F5、F30和F60病毒液,第4组接种PBS作为对照,隔离饲养观察14d,每日测温并记录临床症状,定期采集血液,接种后14d剖杀,观察病理变化。采用荧光定量PCR检测病毒血症及肺脏病毒载量。结果为:F5与F30病毒液均能引起仔猪高热,可引起较高的血液和肺脏病毒水平,肺脏组织可见明显的间质性肺炎。与低代次病毒液相比,F60病毒液攻毒后,病毒血症水平明显降低,临床症状和病理变化明显减轻。证明该病毒株细胞传代后病毒滴度逐步升高,但对仔猪致病性逐渐降低,为PRRSV疫苗研究提供了基础数据。2.PRRSVGP5蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立本研究根据PRRSVFJ1402毒株GP5基因特征,通过删除第三跨膜区、大肠杆菌偏嗜性密码子优化及基因合成,获得GP5/4m基因片段,克隆至pCold-TF大肠杆菌表达载体,构建成功重组质粒pCold-TF-GP5/4m,实现了 GP5蛋白高效可溶性表达。通过镍柱上清纯化法获得纯净的GP5重组蛋白。以该重组蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。结果为:抗原包被浓度1.0～2.0μg/mL,血清样本稀释度1:100,酶标抗体稀释度1:5000,底物显色时间为10 min。判定标准为S/P≥0.279为阳性,S/P＜0.206为阴性,二者之间为可疑。本方法最高能检测到160倍稀释的PRRSV阳性血清,与PRV、FMDV、CSFV、SVA和PCV2血清抗体无交叉反应性,批内批间重复性变异系数为1.17%～6.43%,采用美国IDEXX PRRSV商品化检测试剂盒同时检测306份临床猪血清,其符合率为88.89%。表明该方法具有较高特异性、敏感性和重复性,为PRRSV血清抗体监测提供了有效的检测方法。
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