【摘 要】
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鸭甲型肝炎病毒（Duck Hepatitis A Virus,DHAV）是引起雏鸭病毒性肝炎Duck virus hepatitis,DVH)的主要病原。DHAV有3个血清型,分别为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3,各血清型之间无交叉免疫保护。近年来,雏鸭感染DHAV-3的病例在我国多地发生,危害严重,研究安全有效的DHAV-3疫苗是当务之急。本试验以鸡胚卵黄囊接种连续传代获得DHAV-3
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鸭甲型肝炎病毒（Duck Hepatitis A Virus,DHAV）是引起雏鸭病毒性肝炎Duck virus hepatitis,DVH)的主要病原。DHAV有3个血清型,分别为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3,各血清型之间无交叉免疫保护。近年来,雏鸭感染DHAV-3的病例在我国多地发生,危害严重,研究安全有效的DHAV-3疫苗是当务之急。本试验以鸡胚卵黄囊接种连续传代获得DHAV-3弱毒株,对雏鸭安全、毒力稳定和免疫原性良好,可为进一步开发弱毒疫苗提供病毒材料。本研究的主要内容如下:1毒株的培育鸡胚卵黄囊接种连续传代获得1株鸭甲型肝炎病毒血清3型毒株,第90代病毒（DHAV-3 LCF90）和第100代病毒（DHAV-3 LCF100）对鸡胚的半数致死量(ELD50)分别为10-7.44/0.3m L和10-7.80/0.3m L。经RT-PCR或PCR检测,该毒株仅能检测到DHAV-3的核苷酸片段,而DHAV-1、DHAV-2、鸭星状病毒、鸭源呼肠孤病毒、鸭坦布苏病、鸭瘟、禽流感和禽腺病毒等为阴性。2病毒全基因组序列测定DHAV-3 LCF90病毒全基因组核苷酸序列全长为7777nt,包括5’UTR（651nt）、1个ORF（6756nt）、3’UTR（336nt）以及poly（A）尾巴。DHAV-3 LCF90病毒与其它24株DHAV-3病毒进行同源性和系统进化树分析,结果表明,该病毒与NC株病毒（KU860089.1）相似性最高,全基因组核苷酸序列和多聚蛋白氨基酸序列的相似性分别为98.9%和99.1%。DHV-3 LCF90病毒与强毒株DHAV-3 LC病毒的全基因组序列比对,无碱基的插入或缺失,存在32个位点碱基突变。6个突变碱基位于非编码区,26个位于ORF区。在ORF中,有9个碱基突变导致氨基酸变化,其中结构蛋白仅在VP0蛋白C末端有1个氨基酸发生突变(N254→D254)。DHAV-3 LC病毒在鸡胚传代适应过程中,适应鸡胚不同代次病毒VP0基因的核苷酸及编码氨基酸发生渐进性的突变,DHAV-3 LC株病毒的核苷酸为C1410A1411(氨基酸残基为N254),DHAV-3 LCF20至DHAV-3 LCF50病毒的核苷酸为C1410G1411(氨基酸残基为D254),DHAV-3 LCF60至DHAV-3 LCF100病毒的核苷酸为T1410G1411(氨基酸残基为D254)。3对雏鸭的致病性1日龄雏鸭颈部皮下接种108.0ELD50/0.5m L DHAV-3 LCF90病毒,在7天观察期内全部存活,生长正常,无临床表现。雏鸭接种后72h和168h的血清谷丙转氨酶（ALT）与健康对照组无统计学差异（P>0.05,n=5）,与接种DHAV-3 LC病毒的感染组差异极显著（P<0.01,n=5）;扑杀雏鸭剖检观察无肉眼可见的病理变化及未发现明显的组织结构异常,而感染组雏鸭呈现典型鸭甲型肝炎病毒感染的大体和病理组织学变化。4对雏鸭的毒力稳定性108.0ELD50/0.5m LDHAV-3 LCF90病毒经颈部皮下接种1日龄雏鸭,接种后72h扑杀雏鸭并采集肝脏制备匀浆液（1:5）再次接种雏鸭,连续传代5次。在接种传代过程中,雏鸭全部存活、生长情况、剖检观察均正常,血清谷丙转氨酶与空白对照组差异不显著（P>0.05,n=5）。肝组织无明显的病理组织学变化,但RT-PCR能从肝组织中检测到DHAV-3核苷酸片段,鸡胚接种也能从肝组织匀浆液（1:5）中分离到DHAV-3。第1代至第5代雏鸭肝组织匀浆液（1:5）接种鸡胚,对鸡胚的ELD50分别为10-4.16/0.3m L、10-4.25/0.3m L、10-4.57/0.3m L、10-5.12/0.3m L和10-4.22/0.3m L。5保护力和最低免疫剂量的测定1日龄雏鸭颈部皮下免疫接种2×105.8ELD50/0.3m L DHAV-3 LCF100病毒,3d后用102.25LD50/0.2m L DHAV-3 LC病毒颈部皮下注射攻毒。结果显示,免疫组雏鸭100%存活（10/10）,空白对照组存活10%（1/10）。用1日龄雏鸭颈部皮下接种免疫不同剂量的DHAV-3 LCF100病毒,免疫接种后3d测定攻毒保护指数。3次重复试验的结果表明,1日龄雏鸭接种2.5×104.8ELD50/0.3m L及以上剂量的病毒,攻毒保护指数在85%以上。以上研究结果表明,鸡胚卵黄囊连续传代获得1株DHAV-3弱毒株,对雏鸭不致病、毒力稳定,能诱导雏鸭产生良好的免疫应答。
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