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目的1.观察隔药饼灸对CD大鼠相关炎性因子和炎性通路以及自噬相关指标的影响。2.阐明隔药饼灸通过调节PI3KC相关信号通路,抑制CD大鼠结肠组织过度活化的自噬的相关机制,为隔药饼灸治疗CD的局部效应提供科学依据。3.观察隔药饼灸对CD大鼠血清外泌体中mi RNAs的影响并对自噬相关差异mi RNAs进行验证,进一步探索隔药饼灸治疗CD的整体效应。方法1.将雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组和隔药饼灸组,采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠的方法制备大鼠克罗恩病模型;隔药饼灸组在模型组的基础上给予大鼠隔药饼灸天枢穴（双侧）,气海穴进行治疗;对各组大鼠进行大体肉眼观察,结肠肉眼观察,结肠组织病理学改变观察,并通过RT-q PCR,WB,免疫染色等方法检测相关指标,观察隔药饼灸对CD大鼠相关炎性因子（IL-18,TNF-α）,相关炎性通路（TLR4/My D88/NF-k B）及自噬相关指标（LC3B,p62,Beclin-1,pm TOR）的影响。2.将雄性SD大鼠随机分为模型组,胰岛素+模型组,胰岛素+隔药饼灸组,雷帕霉素+模型组,雷帕霉素+隔药饼灸组,各组大鼠均采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠的方法制备大鼠克罗恩病模型,采用腹腔注射的方法给予胰岛素和雷帕霉素,对各组大鼠进行大体肉眼观察,结肠肉眼观察,结肠组织病理学改变观察,并通过RT-q PCR,WB等方法检测相关指标,观察隔药饼灸对CD大鼠结肠组织PI3KCs相关信号通路指标及自噬相关指标（PI3KC1,Akt,m TOR,PI3KC3,LC3B,p62）的影响。3.通过Illumina Hi Seq TM 2500测序和生物信息学分析,筛选实验一各组大鼠血清外泌体差异mi RNAs并进行靶基因预测,并采用RT-q PCR和荧光素酶报告进行相关验证。结果第一部分1.模型鉴定:TNBS造模后,与正常组大鼠相比,模型组大鼠皮毛发黄无光泽且粗糙凌乱,食量不佳,肛周污秽沾有稀便,垫料脏乱,气味浓烈,暴露腹腔后可见结肠明显缩短,增厚增粗,肠管内明显积气,部分大鼠可见肠组织粘连,巨结肠或肠梗阻;剪开肠道后可见肠黏膜表面欠光滑,肠壁增厚,伴有散在的水肿,充血,溃疡等,溃疡表面沾有粪便不易漂洗等,部分大鼠可见铺路石样改变,提示模型制备成功。2.隔药饼灸对CD大鼠结肠组织相关炎性因子和通路指标m RNA的影响:与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中IL-18、TNF-α、TLR4、My D88,NF-k B p65 m RNA的表达水平均显著上升（P均<0.01）;与模型组相比,隔药饼灸组IL-18、TNF-α、TLR4、My D88,NF-k B p65 m RNA的表达水平均显著下降,差异具有统计学意义（P均<0.05）。3.隔药饼灸对CD大鼠结肠组织相关炎性因子和通路指标蛋白的影响:与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中IL-18、TLR4、My D88,NF-k B p65蛋白的表达水平均显著上升（P均<0.01）;与模型组相比,隔药饼灸组IL-18、TLR4、My D88,NFk B p65蛋白的表达水平均显著下降,差异具有统计学意义（P均<0.05）;与正常组相比,模型组大鼠结肠组织TNF-α蛋白表达量有所上升,但差异无统计学意义（P=0.116）;与模型组相比,隔药饼灸组大鼠结肠组织TNF-α蛋白表达量有所下降,但差异无统计学意义（P=0.575）。4.隔药饼灸对CD大鼠结肠组织相关自噬指标的影响:与正常组相比,模型组大鼠结肠组织LC3B,Beclin-1 m RNA和蛋白的表达水平均显著上升（P均<0.01）;与模型组相比,隔药饼灸大鼠结肠组织LC3B,Beclin-1 m RNA和蛋白的表达水平均显著下降（P均<0.05）;与正常组相比,模型组大鼠结肠组织m TOR,p62 m RNA的表达水平均显著下降（P均<0.01）,与模型组相比,隔药饼灸大鼠结肠组织m TOR,p62 m RNA的表达水平均显著上调（P均<0.05）。与正常组相比,模型组大鼠结肠组织p-m TOR,p62蛋白表达水平均显著降低（P均<0.01）,与模型组相比,隔药饼灸组大鼠结肠组织p-m TOR,p62蛋白表达水平均显著提高（P均<0.05）。第二部分1.隔药饼灸对CD大鼠结肠组织PI3KC1信号通路和自噬相关指标m RNA的影响:与模型组相比,雷帕霉素+模型组大鼠结肠组织PI3KC1、Akt1、m TOR,p62 m RNA的表达水平均有不同程度下调,与雷帕霉素+模型组相比,雷帕霉素+隔药饼灸组大鼠结肠组织PI3KC1、Akt1、m TOR,p62 m RNA的表达水平均显著上调（P均<0.05）;与模型组相比,雷帕霉素+模型组大鼠结肠组织LC3B m RNA表达有所上调,与雷帕霉素+模型组相比,雷帕霉素+隔药饼灸组大鼠结肠组织LC3B m RNA表达显著下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.隔药饼灸对CD大鼠结肠组织PI3KC1信号通路和自噬相关指标蛋白的影响:与模型组相比,雷帕霉素+模型组大鼠结肠组织PI3KC1、p-Akt、p-m TOR,p62蛋白表达水平均有不同程度下调,与雷帕霉素+模型组相比,雷帕霉素+隔药饼灸组大鼠结肠组织PI3KC1、p-Akt、p-m TOR,p62蛋白表达水平均显著上调（P<0.05）;此外,与模型组相比,雷帕霉素+模型组大鼠结肠组织VPS34（PI3KC3）,LC3B蛋白表达水平均有不同程度上调,与雷帕霉素+模型组相比,雷帕霉素+隔药饼灸组大鼠结肠组织VPS34（PI3KC3）,LC3B蛋白表达水平均显著下调（P<0.05）。第三部分1.大鼠血清外泌体mi RNAs高通量测序:大鼠血清外泌体小RNA浓度与质检,测序质控均合格,模型组和正常组相比,差异极显著的mi RNAs为26个（P<0.01）,差异显著的mi RNAs为41个（P<0.05）;模型组和隔药饼灸组相比,差异极显著的mi RNAs为15个（P<0.01）,差异显著的mi RNAs为27个（P<0.05）;与正常组相比,模型组差异mi RNAs的表达以上调居多;与模型组相比,隔药饼灸组差异mi RNAs的表达以下调居多;KEGG分析表明各组大鼠差异mi RNAs的靶基因功能均在PI3KAkt等信号通路具有较高的富集程度;2.自噬相关mi RNAs的筛选及验证:正常组和模型组,模型组和隔药饼灸组之间,有7个共有的差异极显著（P<0.01）mi RNAs和11个共有的差异显著（P<0.05）mi RNAs,比对数据库并结合查阅文献,挑选出相对更可能对自噬产生影响的mi RNAs分别为rno-mi R-30b-5p,rno-mi R-142-3p,rno-mi R-106b-5p,rno-mi R-30c-5p,RT-q PCR验证表达趋势与测序趋势具有一致性,荧光素酶报告基因表明ATG12,ATG5为mi R-30b-5p的靶基因。结论1.隔药饼灸可以抑制CD大鼠结肠组织促炎因子IL-18,TNF-α及炎性通路TLR4/My D88/NF-k B的表达,抑制炎症过程中过度激活的自噬,从而缓解CD大鼠的各项症状及病理改变,发挥治疗作用;2.隔药饼灸可能通过激活PI3KC1-Akt-m TOR信号通路,抑制PI3KC3（VPS34）相关蛋白复合物,从而发挥抑制过度自噬的作用;3.隔药饼灸可以下调TNBS诱导的克罗恩大鼠血清外泌体中多数mi RNAs的表达,其中4个差异mi RNAs（rno-mi R-30b-5p,rno-mi R-142-3p,rno-mi R-106b-5p,rno-mi R-30c-5p）PCR检测结果与测序结果趋势具有一致性,且mi R-30b-5p对ATG12,ATG5具有靶向调控作用,提示隔药饼灸可能通过抑制CD大鼠血清外泌体中miR-30b-5p从而发挥调控自噬的作用。