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膝关节骨性关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）是多因素所导致的中老年人常见病和多发病,严重影响中老年人的身体健康和生活质量。软骨细胞退变是KOA发病的基础,而力学因素在软骨细胞退变中的作用机制一直以来都是研究的热点。本研究在力学刺激干预后软骨细胞差异表达蛋白质组学研究研究的基础上,进一步研究与力学刺激密切相关的整合素、Hippo/YAP信号通路变化,以及理筋手法干预后上述信号通路变化的规律,以期明确中医传统手法治疗KOA的作用机理。第一部分周期性压应力下膝骨关节炎软骨细胞差异表达蛋白质组学研究目的:应用蛋白组学技术观察周期性压力干预下KOA软骨细胞蛋白质差异表达变化。方法:将二周龄雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组和压力组,每组4只。正常组在常规的培养环境下,应用常规的压力进行培养;模型组在常规压力条件下,在培养基中加入TNF-α试剂模拟OA炎症环境培养;压力组在培养基中应用TNF-α刺激软骨细胞模拟OA炎症环境下,应用Flexcell-5000细胞牵张拉伸应力加载系统予以172k Pa、2Hz的周期性压应力,时间为60 min/d,连续干预3天。应用液相色谱-质谱系统（LC-MS/MS）对各组软骨细胞差异表达蛋白质进行分析研究。结果:本研究质谱鉴定,共鉴定肽段总数为7874个,鉴定到蛋白质总数为1697个。模型组与正常组相比上调差异表达蛋白质数量为81个,下调表达差异蛋白质数量为128个;压力组与正常组相比调差异表达蛋白质数量为333个,下调表达差异蛋白质数量为194个。差异表达蛋白质GO功能富集分析结果显示,与整合素β1（Integrin-β1,ITG-β1）相关的膜结合细胞器细胞组分以及与Hippo/YAP信号通路核心蛋白相关的细胞内细胞组分均出现了显著性的变化。差异表达蛋白质KEGG通路富集分析结果显示,模型组与正常组相比,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路,蛋白酶体通路,脂肪酸降解通路和粘合连接通路等发生了显著变化。在周期性压力干预后,与正常组相比,压力组在剪接体通路,碳代谢通路,柠檬酸循环通路,丙酮酸盐代谢通路,RNA转运通路和蛋白酶体通路等通路发生了显著变化。进一步的差异蛋白筛选分析提示,ITG-β1蛋白以及与ITG-β1蛋白密切相关的肌动蛋白变化,以及与Hippo/YAP信号通路密切相关的蛋白MOB1、Cry61、Smad2均出现了显著的变化。结论:在炎性因子刺激下以及周期性压力干预后ITG-β1蛋白及其密切相关的肌动蛋白,Hippo/YAP信号通路相关蛋白MOB1、Cry61、Smad2等均出现显著变化,提示上述信号通路可能在调控软骨细胞代谢过程中可能具有重要作用。第二部分周期性压应力对软骨细胞整合素β1-Hippo/YAP信号通路影响的实验研究目的:观察KOA软骨细胞ITG-β1、Hippo/YAP信号通路相关蛋白表达变化以及周期性压应力对其的影响。方法:将二周龄雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组和压力组,每组4只。正常组在常规的培养环境下,应用常规的压力进行培养;模型组在常规压力条件下,在培养基中加入TNF-α试剂模拟OA炎症环境培养;压力组在培养基中应用TNF-α刺激软骨细胞模拟OA炎症环境下,应用Flexcell-5000细胞牵张拉伸应力加载系统予以172k Pa、2Hz的周期性压应力,时间为60 min/d,连续干预3天。应用TUNEL技术和ELISA技术观察各组大鼠软骨细胞细胞凋亡以及凋亡相关蛋白表达变化,应用RT-PCR技术和Western Blot技术观察ITG-β1和Hippo/YAP信号通路MST1、YAP1、TEAD的核心组成基因和蛋白表达变化。并应用Logistic线性回归分析观察ITG-β1与MST1、YAP基因和蛋白表达的相关性。结果:模型组软骨细胞出现显著凋亡现象,周期性压应力干预后,软骨细胞凋亡数量较模型组显著下降（P<0.01）。与正常组相比,模型组凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著降低,Bax表达显著升高,两者相比有显著性差异（P<0.01）,应用周期性压力干预后,与模型组相比,压力组凋亡相关蛋白Bcl-2表达明显上升,而Bax表达下降,两者相比有显著性差异（P<0.05）。模型组软骨细胞ITG-β1 m RNA表达显著降低,与正常软骨相比有显著性差异（P<0.01）,而周期性压力干预后,软骨细胞ITG-β1 m RNA和蛋白均出现表达会出现明显的上调,与模型组相比有显著性差异（P<0.01和P<0.05）。RT-PCR研究显示,模型组软骨细胞Hippo/YAP信号通路的下游转录共激活因子YAP1和TEAD m RNA的表达均显著降低,与正常软骨相比均有显著性差异（P<0.01）;Western blot的结果也进一步验证,YAP1蛋白在模型组软骨细胞中的表达显著降低。周期性压力干预后,与模型组相比,YAP1蛋白和m RNA以及TEAD m RNA的表达均显著升高（P<0.01）,而MST1m RNA表达升高不显著（P>0.05）。Logistic线性回归分析结果显示,ITG-β1与MST1基因表达变化有显著性相关（r=0.864,P<0.01）;,ITG-β1与YAP基因和蛋白表达变化均有显著性相关（r=0.779和r=0.851,P<0.01）。结论:ITG-β1可能分别通过Hippo/YAP信号通路和其他信号通路参与调控YAP蛋白及其靶蛋白的变化进而调控软骨细胞的代谢。第三部分理筋手法对KOA大鼠模型膝关节整合素-Hippo/YAP信号通路的影响目的:观察理筋手法对KOA大鼠膝关节软骨ITG-β1、Hippo/YAP信号通路相关蛋白表达变化的影响。方法:将SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组和手法组,每组10只。采用课题组前期设计和建立的内侧副韧带切除联合髌韧带部分切除大鼠KOA模型。于造模4周后,对手法组大鼠进行理筋手法干预治疗,每次7min,隔日治疗1次,连续干预6周。正常组和模型组不予干预。应用HE染色观察各组大鼠膝关节软骨形态学改变,应用TUNEL技术各组大鼠软骨细胞凋亡达变化,应用RT-PCR技术和Western Blot技术观察ITG-β1和Hippo/YAP信号通路MST1、YAP1、TEAD的核心组成基因和蛋白表达变化。并应用Logistic线性回归分析观察ITG-β1与MST1、YAP基因和蛋白表达的相关性。结果:正常组大鼠膝关节软骨,膝关节软骨表面基本光滑,软骨细胞呈梭形、水平状排列,潮线结构清晰完整。模型组大鼠膝关节软骨表面出现中度磨损,软骨细胞丢失明显。手法组大鼠膝关节软骨表面出现轻度磨损,软骨细胞形态接近正常,软骨细胞簇集现象较少。与正常组相比,模型组Mankin评分显著增高（P<0.01）,手法治疗后,Mankin评分与模型组相比显著下降（P<0.01）,但仍高于正常组（P<0.01）。流式细胞检测结果显示,模型组与正常组相比有显著性差异（P<0.01）,理筋手法干预后,软骨细胞凋亡率与模型组相比有显著性差异（P<0.05）。模型组软骨ITG-β1 m RNA表达显著降低,与正常相比有显著性差异（P<0.01）,理筋手法干预后,ITG-β1 m RNA和蛋白均出现表达会出现明显的上调,与模型组相比有显著性差异（P<0.01）。RT-PCR和Western blot研究显示,模型组软骨Hippo/YAP信号通路的下游转录共激活因子MST1、YAP1和TEAD m RNA和YAP1蛋白的表达均显著降低,与正常相比均有显著性差异（P<0.01）。理筋手法干预后,与模型组相比,YAP1蛋白和m RNA以及TEAD m RNA的表达均显著升高（P<0.01）,而MST1m RNA表达升高不显著（P>0.05）。Logistic线性回归分析结果显示,ITG-β1与MST1基因表达变化有显著性相关（r=0.748,P<0.01）;,ITG-β1与YAP基因和蛋白表达变化均有显著性相关（r=0.926和r=0.858,P<0.01）。结论:理筋手法可以延缓软骨细胞退变,其力学刺激效应部分是通过ITG-β1参与经典的Hippo/YAP信号通路调控,同时还存在其他未知的信号通路参与ITG-β1对YAP蛋白的调控。