研究背景:世界范围内,心血管疾病是致死,致残的主要原因之一,给社会带来了巨大的经济负担。2019年,国内外权威机构调查统计结果显示,心血管疾病的总体死亡率较前有所下降,但缺血性心脏病的发病率和死亡率仍处于上升趋势。对于缺血性心脏病的治疗,药物及手术的血管再通治疗至关重要。然而,在血管再通改善心肌细胞缺血缺氧的同时,仍有部分心肌细胞出现不可逆性的死亡。对其病理生理机制研究发现,在缺血缺氧阶段,由于线粒体去极化、ATP耗竭、钠离子与钙离子超载及活性氧的释放,可引起心肌细胞出现凋亡、焦亡、铁死亡及坏死等一系列细胞的死亡,最终导致心肌梗死。在这一过程中细胞自噬水平亦进一步升高。而血管再通后,由于ATP、PH的改变,钙离子超载及活性氧的释放,会导致心肌细胞进一步的死亡,我们称之为急性心肌梗死后缺血再灌注损伤。现有的治疗策略难以逆转心肌梗死后心肌细胞的丢失及死亡,对于如何解决这一问题,减少心肌缺血再灌注损伤的发生发展,对于降低心肌梗死后的死亡率至关重要,也是目前生命科学领域亟待解决的问题之一。随着干细胞研究的进展及技术的突破,其在心血管疾病中的应用潜力巨大。新近研究结果显示,抑制的干细胞主要通过旁分泌机制发挥生物学功能。其中,因外泌体具有脂质双分子层结构及富含多种生物活性物质,在旁分泌机制中占据重要地位。外泌体来源广泛,包括心脏祖细胞、间充质干细胞在内的成体干细胞及诱导多功能干细胞与其分化的细胞均可分泌外泌体。分泌的外泌体可通过内源性祖细胞、血管再生、炎症及心肌细胞的增殖、存活、凋亡等多方面发挥调控功能,最终起到心脏保护作用。外泌体中富含多种蛋白质、脂质、非编码RNA等生物活性物质。新近研究结果显示,心肌梗死微环境可激活骨髓中的单核细胞,促使其分泌富含miRNA的外泌体,外泌体迁移至损伤部位起到心脏修复功能。而本课题组前期研究发现缺氧预处理骨髓间充质干细胞(Hypoxia preconditioning-Bone Mesenchymal Stem cells,HPC-BMSC)源外泌体可传递miR19b至受损的心肌细胞,通过抑制Bnip3l的翻译起到抗凋亡、抑制自噬的生物学功能。除miRNA外,外泌体中富含多种长链非编码RNA(Longnon-coding RNA,LncRNA)。那么,LncRNA是否可通过外泌体的传递而发挥心脏保护功能呢?目前,其分子机制尚未完全阐明。故此,本研究通过对常氧状态、缺氧复氧状态及HPC-BMSC源外泌体处理组的H9c2心肌细胞送检LncRNA-mRNA芯片,对芯片进行生信分析,获取目的基因。并在此基础上观察HPC-BMSC源外泌体中LncRNA对缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡和自噬的影响及潜在分子机制,为干细胞的非细胞治疗提供新的实验依据。第一部分缺氧复氧后H9c2心肌细胞中凋亡自噬相关的LOC100360491的筛选及生物信息学分析目的:根据lncRNA芯片筛选出HPC-BMSC源外泌体中,参与缺氧复氧后H9c2心肌细胞凋亡及自噬的LncRNA并进行生物信息学分析。方法:(1)送检上海康成生物有限公司进行Arraystar大鼠lncRNA V2.0芯片分析,对HR组(缺氧24h复氧6h处的H9c2心肌细胞)、Nor组(不做任何处理的H9c2心肌细胞)和HPC-Exo组(将400ng/μL HPC-BMSC源外泌体与H9c2心肌细胞常氧状态共培养12h后进行缺氧24h复氧6h处理)进行分析研究,并采用RT-PCR对芯片结果进行验证。根据芯片结果进行GO/pathway、共表达网络及功能富集等分析,综合分析结果,筛选出目的lncRNA。(2)在体外研究中,通过转染OE/shLncRNA的慢病毒,以此过表达及干扰H9c2心肌细胞中目的基因,探讨其在缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡及自噬中的调控功能。结果:(1)芯片结果显示:通过显著分析(Fold change>2,P<0.05)发现,相比Nor组,HR组表达差异的LncRNA共375条,mRNA共1398条,其中LncRNA中308条显著上调,mRNA中1154条显著上调;有49条LncRNA和244条mRNA表达显著下调。对差异性表达的mRNA进行GO分析结果显示,上调的mRNA主要富集在细胞生物过程调节、细胞间信号传导、离子转运等。而下调的mRNA其功能主要富集在细胞代谢过程、RNA结合、蛋白结合等过程中。KEGG pathway分析结果显示,上调的mRNA其KEGG pathway主要富集在补体和凝固级联、谷氨酸能突触、钙信号通路、TRP通道的炎症介质调节等;下调的mRNAs其KEGG pathway主要富集在内质网中蛋白加工、细胞周期、RNA转运及氧化磷酸化等过程中。相比HR组,HPC-Exo组中表达显著上调lncRNA有840条,mRNA有1937条,表达显著下调的lncRNA有340条,mRNA有801条。在生物学进程方面,表达显著上调的mRNA主要富集在细胞代谢、细胞氮化合物代谢过程、基因表达等。在细胞组分方面,表达上调的mRNA主要富集在细胞内、部分细胞内、细胞器内等。而在分子功能方面,表达上调的mRNA主要富集在结合、蛋白结合、杂环化合物结合等。而表达下调的mRNA在生物学进程、细胞组分及分子功能方面分别主要富集于有机物反应、内质网及蛋白域特异性结合中。KEGG pathway分析结果发现表达上调的mRNA主要富集于核糖体及氧化磷酸化中;下调的mRNA主要富集于PI3K-AKT信号通路中。随后采用编码-非编码基因共表达网络,通过关联GO和KEGG对应的mRNA来研究lncRNA的功能。结果发现:与细胞凋亡有潜在作用关系的mRNA主要包括Smndc1、Mef2d、Bnip1、Bad、Aqp2、Xbp1、Rack1、Plekhf1、Hif3a等,而与这些mRNA有直接相邻的lncRNA包括XR-351145、XR-343601、XR-599858、XR-344466、XR-594628、XR-594627等。(2)使用U6作为参考基因,随机选取差异性表达Fold change>2倍的5条LncRNA进行RT-PCR验证,结果显示与lncRNA芯片检测结果一致。(3)据以上分析,我们得出LOC100360491和RGD1563905为候选LncRNA,而结合HR组、Normal组和HR组、HPC-Exo组的RT-PCR结果发现LOC100360491更具差异性表达,最终我们筛选出LOC100360491为目的LncRNA,并构建特异性表达的OELOC100360491和shLOC100360491的慢病毒及相应空载体,转染H9c2心肌细胞中分别检测其早期凋亡细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻、中期凋亡活性氧(ROS)的释放及晚期凋亡DNA片段化等情况的变化。结果显示:相比HR组,OELOC100360491组,H9c2心肌细胞磷脂酰丝氨酸外翻、ROS的释放及DNA片段化情况均显著下降,均具有统计学意义(p<0.05)。在蛋白水平,相比HR组,HPC-Exo组凋亡执行蛋白Actived-caspase 3、Actived-caspase 9、Bcl-2及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著下调,而抗凋亡蛋白Bax、抗自噬蛋白P62表达显著上调。而将HPC-BMSC源外泌体中的目的LncRNA沉默后,Actived-caspase 9表达并未见明显变化,但Actived-caspase 3、Bcl-2等相比HPC-Exo组表达显著上调。而抗凋亡蛋白Bax及抗自噬蛋白p62在HPC-Exo+shLOC100360491组中的显著下调。结论:HPC-BMSC源外泌体中的LOC100360491可抑制缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡及自噬。第二部分HPC-BMSC源外泌体中LOC100360491通过miR107-5p/PAK3抑制缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡及自噬目的:在确认HPC-BMSC源外泌体中LOC100360491的抗心肌细胞抗凋亡、抑制自噬的作用后,我们对其具体分子机制进行探索。方法:(1)运用荧光原位杂交的方法探索LOC100360491在H9c2心肌细胞中的亚定位;生物信息学预测LOC100360491可能的作用靶点。流式细胞术检测早期凋亡细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻、中期凋亡ROS的释放及晚期凋亡DNA片段化等情况的变化,RT-PCR、WesterBlot检测基因在转录及转录后的表达。结果:(1)荧光原位杂交结果显示LOC100360491主要亚定位于H9c2心肌细胞的细胞质中。通过生物信息学分析得出包括miR103-1-5p、miR107-5p、miR125a-5p、miR125b-5p、miR351-5p、miR423-5p、miR3573-5p在内的7个可能的下游miRNA。使用RT-PCR检测上述miRNA的表达,结果显示,相比Control组,OE LOC100360491组,上述候选miRNA表达显著下调。随后shRNA特异性敲降LOC100360491的表达后,相比Nor组,仅仅miR103-1-5p、miR107-5p及miR125b-5p表达上调,其中miR107-5p差异最为明显,这表明LOC100360491、miR107-5p之间存在一定联系。RT-PCR结果显示PAK3及CNNM2的表达在各分组间无统计学差异。Western Blot结果显示CNNM2的蛋白表达在各分组均无统计学意义。相比Control组,miR107-5p mimic组中,PAK3表达显著下调,miR107-5p inhibitor组的PAK3表达显著上调。(2)为进一步探索LOC100360491-miRNA107-5p在缺氧复氧的H9c2心肌细胞中的作用,我们分别在H9c2心肌细胞中转染miR107-5p的mimic、inhibitor及相应的空载体质粒,结果显示:相比HR组,miR107-5p inhibitor组H9c2心肌细胞凋亡(早凋、中凋)明显下降,miR107-5p mimic组细胞凋亡有所升高,但差异性并不显著。提示抑制H9c2心肌细胞中miR107-5p可抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡。HPC-BMSC源外泌体中miR107-5p mimic组相比HPC-Exo组,其抗凋亡作用明显减弱。在蛋白水平亦发现,凋亡相关蛋白Actived-caspase3、Bax表达在HR组显著升高,用HPC-Exo处理后其表达量有所下降,而HPC-BMSC源外泌体miR107-5p mmic组中凋亡相关蛋白Actived-caspase3、Bax的表达显著上调,抗凋亡相关蛋白Bcl-2呈现相反的趋势。自噬方面,结果显示LC3 Ⅱ/Ⅰ表达在HR组明显升高,在HPC-Exo处理组显著下降,HPC-BMSC源外泌体miR107-5p mimic组,LC3 Ⅱ/Ⅰ再次升高,自噬抑制蛋白的表达呈现相反的趋势。结论:HPC-BMSC源外泌体中的LOC100360491通过“海绵样作用”结合miR107-5p,解除其对下游靶基因PAK3的抑制,从而抗凋亡、抑制自噬,最终起到心肌保护效应。第三部分HPC-BMSC源外泌体中LOC100360491抑制大鼠心肌梗死后凋亡及自噬目的:在大鼠心肌梗死模型中验证LOC100360491的作用。方法:采用慢病毒心肌内注射体内转染shLOC100360491、shRNA NC,从而特异性干扰大鼠心脏中LOC100360491的表达,随后结扎大鼠心脏左前降支建立心肌梗死模型,7天后通过TTC染色评估心肌梗死面积,HE检测心肌纤维化。Western Blot检测凋亡及自噬相关蛋白表达。结果:相比Sham组,MI组心肌梗死面积及纤维化显著增加;相比MI组,HPC-Exo组中心肌梗死面积、纤维化程度明显减少;相比HPC-Exo组,shLOC100360491组心肌梗死面积及纤维化程度显著升高,shRNA NC组则无明显变化。凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、Bax,自噬相关蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ在MI组显著上调,抗凋亡蛋白Bcl-2、抑制自噬蛋白p62显著下调。而HPC-Exo组中Actived-caspase3、Bax、LC3 Ⅱ/Ⅰ表达显著下调,Bcl-2、p62表达显著上调。相比HPC-Exo组,shLOC100360491组上述蛋白呈现相反趋势。shRNA NC组无明显变化。结论:HPC-BMSC源外泌体中LOC100360491抑制大鼠心肌梗死后凋亡及自噬的调控。