禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia.coli,APEC）引起严重危害养殖业发展的重要细菌性传染病,APEC与尿道致病性大肠杆菌（UPEC）和新生儿脑膜炎大肠杆菌（NMEC）同属肠外致病性大肠杆菌（Ex PEC）,APEC与上述两种感染人的致病性大肠杆菌有高度的基因同源性,具有重要的公共卫生学意义。非编码小RNA（s RNA）在细菌中普遍存在,不直接翻译蛋白但是细菌重要的调控因子,在细菌致病性调控上发挥着重要作用。研究表明细菌中发现约140种s RNA,存在于大肠杆菌中近90种,此中Ryh B是现在报道调控细菌靶m RNA数量最多的s RNA,最开始发现于大肠杆菌中。Ryh B普遍存在于大肠杆菌包括APEC中,其作为APEC关键的调节因子,可通过影响APEC生物被膜形成、趋化性以及耐酸性等方面的来调控APEC的致病性。本实验室前期已构建AE17Δryh B并进行Label-free蛋白组学测序及生物信息学预测筛选出Ryh B的靶基因cys E。本研究利用Red重组技术在AE17、AE17Δryh B的基础上,进一步构建基因缺失株AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E,针对单双缺失株及野生株进行转录组学测序分析并比较其生长曲线、运动性、生物被膜形成能力等生物学特性差异及致病性强弱,为研究cys E基因的功能、调控作用及cys E与ryh B基因之间的调控作用奠定基础。详细研究内容如下:1.禽致病性大肠杆菌Δcys E、Δryh BΔcys E AE17菌株的构建极其致病性分析本实验在野生菌株AE17及已构建AE17Δryh B的基础上采用Red同源重组技术,构建cys E基因的单双缺失株。经cys E-IN-F/cys E-IN-R、cys E-OUT-F/cys E-OUT-R、ryh B-IN-F/ryh B-IN-R、ryh B-OUT-F/ryh B-OUT-R引物PCR验证以及测序检测显示成功构建出cys E基因单缺株AE17Δcys E及双缺株AE17Δryh BΔcys E。采用CCK-8检测各菌株感染DF-1细胞细胞存活率确定菌株感染DF-1细胞模型的条件为细菌单菌落数与细胞数比例为1:50且共培养时间为2h。通过FITC和PI双染观察细胞凋亡情况、流式检测细胞凋亡率以及动物攻毒试验LD₅₀的测定得出AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E的毒力与AE17相比均有所下降。2.AE17、AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E RNA-Seq分析本实验针对AE17、AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E进行转录组学测序分析,筛选出AE17Δryh B与AE17差异基因1001个,此中上调的有459个,下调的有542个;AE17Δcys E与AE17差异基因1232个,此中上调有625个,下调有607个;AE17Δryh BΔcys E与AE17差异基因991个,此中上调有475个,下调有516个。AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E与AE17相比差异基因共有668（67.41%）个基因重叠。GO分类分析得出各缺失菌株与野生菌株的差异基因富集于氧化代谢过程及氧化还原过程等。KEGG分析得出各缺失菌株与野生菌株的差异基因富集于不良环境中微生物代谢、鞭毛组装以及β-内酰胺耐药性等。荧光定量PCR验证差异基因得出cys E基因缺失后APEC生物被膜形成及运动性相关基因转录水平下降,ryh B、cys E基因缺失后APEC运动性相关基因转录水平较cys E基因缺失后有所提高。3.AE17、AE17Δryh B、AE17Δcys E、AE17Δryh BΔcys E的生物表型分析本实验通过对野生株和缺失株的生长曲线的测定得出ryh B缺失后以及ryh B、cys E共同缺失后对APEC生长速度无影响,cys E缺失后APEC生长速度在对数期有所降低。结晶紫改良法生物被膜形成能力测定以及扫描电镜观察生物被膜形成能力得出各缺失菌株与野生菌株相比生物被膜形成能力均显著降低。运动能力测定结果显示AE17Δryh B运动能力与AE17相比无明显变化,AE17Δcys E运动能力与AE17相比显著下降（p<0.0001）,AE17Δryh BΔcys E运动能力与AE17相比下降（p<0.05）;透射电镜观察细菌鞭毛数目得出各缺失菌株鞭毛数目与野生菌株相比均减少,其中AE17Δryh B、AE17Δryh BΔcys E比AE17Δcys E数目多,结合荧光定量PCR运动性相关的基因转录水平的差异得出cys E基因的缺失降低了APEC运动能力,ryh B基因对cys E基因运动能力调控作用有代偿作用。