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抗缪勒氏管激素（Anti-Müllerian hormone,Amh）属于转化生长因子TGF-β（Transforming growth factorβ）超家族的成员,广泛参与脊椎动物细胞增殖、分化、凋亡和迁移的调控。在四足动物中,Amh最原始的功能是促进雄性胚胎中缪勒氏管的退化。随后的研究发现Amh在精巢的支持细胞和卵巢的颗粒细胞中也有表达,在雌雄配子发生过程中抑制精巢中精原细胞的增殖和卵巢中原始卵泡的招募。硬骨鱼类没有缪勒氏管,但依然保留了amh及其二型受体amhr2。与哺乳类相似,amh主要表达于斑马鱼和青鳉雄性精巢的支持细胞以及雌性卵巢的颗粒细胞中并具有与哺乳动物amh相似的功能。近年来,amh的复制基因amhy及其受体amhr2被广泛报道作为硬骨鱼类的雄性性别决定基因。在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中,X染色体上的amh在Y染色体上发生串接复制,Y染色体上amh退化为amh△-y,复制基因amhy被证实是尼罗罗非鱼的雄性性别决定基因。罗非鱼具有产卵周期短、可获得单性鱼苗等优点,且雄性比雌性生长快50%。生产遗传全雄罗非鱼（Genetic Male Tilapia,GMT）一直是水产养殖的首选,此方法中获得可育的YY伪雌鱼是必不可少的条件,但目前YY雄鱼难于诱导为YY伪雌鱼,即使诱导为YY伪雌鱼也不能正常繁殖,严重阻碍了GMT的应用与推广。本研究旨在解析amh/amh△-y/amhy在生殖中的功能以及YY雄鱼难于诱导性逆转且育性低甚至不育的原因。本研究在理论上有助于认识复制基因特别是串接复制基因在进化过程中的功能互补或冗余,丰富对amh基因在硬骨鱼类,乃至在脊椎动物雌雄生殖中的认知,在实践上有助于培育可育YY伪雌鱼,为GMT的应用与推广奠定基础。具体研究结果如下:1、amh/amh△-y/amhy及amhr2在罗非鱼的表达研究。在XX雌鱼中,RT-q PCR（Quantitative real-time PCR）分析显示amh和amhr2在30和60 dah（day after hatching）（卵泡的初级生长期）的卵巢中高表达,随后在90至180 dah降低。免疫组化显示Amh在I和II时相的卵泡颗粒细胞中特异表达,而在III和IV时相卵泡中不表达。Amhr2仅在卵原细胞、I时相的卵母细胞和颗粒细胞中表达,在II至IV时相的卵泡中不表达。此外,RT-q PCR和免疫组化结果显示Amh和Amhr2在脑和垂体中也有表达。在雄鱼中,荧光免疫组化显示Amh/Amhy在5 dah的XY和YY雄鱼精巢支持细胞中表达。此外,与XY雄鱼相比,YY雄鱼中的Amhy表达水平更高。在30、90和180 dah的精巢中,Amhy在YY雄鱼中表达较低,而XY雄鱼中Amh则在支持细胞中高表达。2、amh/amh△-y/amhy及amhr2突变对XX雌鱼和XY伪雌鱼卵子发生的影响。在已有F0代突变嵌合体的基础上,通过传代建系在XX雌鱼中成功获得F2代amh和amhr2纯合突变鱼,并分析了纯合突变鱼性腺表型,发现amh-/-和amhr2-/-鱼均表现出肥大的卵巢且不育。组织学分析显示,与野生型（wild type,WT）相比,3月龄amh-/-和amhr2-/-鱼卵巢中卵原细胞显著增多,但I和II时相卵泡的数量没有显著差异。PCNA（proliferating cell nuclear antigen）增殖实验表明amh-/-和amhr2-/-鱼卵巢中卵原细胞过度增殖。6月龄WT雌鱼卵巢中包含I至IV时相的卵泡,而amh-/-和amhr2-/-鱼卵巢中仅存在I至II时相的卵泡,表明突变鱼卵泡发育停滞在初级生长阶段。amh-/-和amhr2-/-鱼卵巢中的卵原细胞、I和II时相卵泡数量均显著多于WT雌鱼卵巢。此外,amh-/-和amhr2-/-鱼血清中雌激素水平显著下调,但外源雌激素处理无法回救其卵泡发育的停滞。TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end-labeling）凋亡实验表明amh-/-和amhr2-/-鱼卵巢中颗粒和鞘膜细胞凋亡显著增加,这可能是卵泡发育停滞的原因之一。通过RT-q PCR和原位杂交等实验分析了amh和amhr2的纯合突变对脑-垂体-性腺轴基因表达的影响。结果显示amh-/-和amhr2-/-鱼脑中的gnrh3基因,垂体中的fsh和lh表达显著下调,性腺中卵泡发育相关基因cyp17a1、cyp17a2、foxl2、inha、fshr和lhr等也显著下调。综上所述,amh或amhr2纯合突变均导致XX鱼卵原细胞过度增殖和卵泡发育停滞,从而产生肥大的卵巢。结合Amh和Amhr2在脑和垂体的表达,表明amh可能不仅仅通过性腺,还通过脑-垂体-性腺轴调控卵泡的发育。为了研究复制基因amh/amh△-y/amhy是否存在功能互补或冗余,本研究在XY雄鱼中构建了多种不同的突变组合。amh单突变的XY鱼为雄性,经雌激素诱导性逆转后卵泡发生正常且可育,而amhy单突变和amhy/amh△-y双突变导致XY雄鱼由雄向雌性逆转,这样的XY伪雌鱼卵泡发生正常且可育。amh/amhy双突变或amh/amh△-y/amhy三突变的XY雄鱼虽也性逆转为雌鱼,但均表现出生殖细胞过度增殖,卵泡发育停滞在初级生长阶段而不育,与amh纯合突变的XX雌鱼表型相似。表明在没有amh的情况下,amhy可以补偿amh的功能,而amh△-y则不能。3、amh/amh△-y/amhy突变对精子发生的影响。为了研究amh/amh△-y/amhy在精子发生中的功能,在XY雄鱼中建立了amh突变(XY-amh-/Y)和amh△-y突变(XY-amh△-yX/-)的雄鱼、在YY雄鱼中建立了amhy杂合突变(YY-amhy+/-)的雄鱼。Brd U（5-Bromo-2′-deoxyuridine）增殖实验表明XY-amh-/Y雄鱼精原细胞过度增殖,从而导致性成熟的突变鱼性腺成熟系数GSI（Gonadosomatic index）显著增大,精子增多。XY-amh△-yX/-雄鱼精子发生正常。YY雄鱼天然不具有amh基因,但精子发生正常,而YY-amhy+/-雄鱼精原细胞过度增殖,GSI增大,表现出与XY-amh-/Y雄鱼相似的表型。由于amhy在精子发生期间仍然低量表达,说明YY雄鱼没有amh精子发生正常可能是由于amhy弥补了amh的功能,而amh△-y在精子发生中无功能。4、YY伪雌鱼不育原因分析与可育YY伪雌鱼的培育。为了获得可育的XY和YY伪雌鱼,用雌激素（E2,200ug/g饲料）对XY和YY雄鱼进行性逆转诱导,从授精后5天开始连续处理3个月,发现XY雄鱼易于诱导性逆转（性逆转率接近100%）且可育;而YY雄鱼难于诱导性逆转（性逆转率仅30%左右）,YY伪雌鱼卵泡发生正常,但其雌激素不足、雄激素过高,生殖乳突表现出雄性特征且不育。我们推测YY雄鱼难于诱导性逆转可能与其存在两个拷贝的amhy有关。为了验证此推测,本研究分析了Amh/Amhy在XY和YY伪雌鱼的表达,在YY雄鱼中构建了amhy的杂合(YY-amhy+/-)和纯合(YY-amhy-/-)突变体并分析了其表型。结果表明Amh/Amhy仅在XY伪雌鱼I、II时相卵泡的颗粒细胞中表达,在III、IV时相卵泡中不再表达,而Cyp19a1a在III、IV时相卵泡的颗粒细胞中表达,两者呈现拮抗式的表达模式。但在YY伪雌鱼中,Amhy不仅在I、II时相,也在III时相卵泡的颗粒细胞高表达。从而抑制了Cyp19a1a在III、IV时相卵泡颗粒细胞的表达。对YY突变体的分析发现,YY-amhy+/-鱼性腺发育为精巢,像XY雄鱼一样,YY-amhy+/-雄鱼易于诱导性逆转、卵泡发生正常且可育,而YY-amhy-/-鱼发生由雄向雌的性逆转,性腺发育为卵巢,但与XX-amh-/-鱼相似,生殖细胞过度增殖导致卵巢肥大,GSI显著升高,卵泡发生停滞在初级生长阶段。这些结果进一步证明在没有amh的情况下,amhy可以补偿amh在卵泡发育中的功能。YY雄鱼难于用雌激素诱导性逆转的主要原因可能是amhy加倍导致其对外源雌激素的拮抗增强。因此,YY伪雌鱼雌激素水平显著低于XY伪雌鱼,此外,其雄激素水平显著高于XY伪雌鱼。表明YY伪雌鱼雄激素过高、雌激素不足可能是导致其表现出雄性第二性征,最终导致不育的原因。基于此,本研究采用添加雌激素处理的同时添加雄激素合成酶抑制剂来诱导YY雄鱼性逆转,其性逆转率由30%提高到90%左右。并在YY伪雌鱼的卵黄发生期（150-180 dah）也添加低量的雌激素和雄激素合成酶抑制剂处理以抑制过高的雄激素,从而让YY伪雌鱼表现出雌性的性征,不出现雄性性征,育性实验表明此方法获得的YY伪雌鱼育性正常。综上所述,amh通过其二型受体amhr2在配子发生过程中抑制生殖细胞的增殖,结合amh和amhr2在脑和垂体的表达,表明其可能通过脑-垂体-性腺轴调控生殖细胞的增殖和发育。罗非鱼amh突变引起雌雄生殖细胞的过度增殖和性腺肥大,卵泡发生停滞在初级生长阶段,不能过渡到次级生长从而导致雌性不育,但雄鱼能进行精子发生且可育。通过amh/amh△-y/amhy不同的突变组合进一步证实了amhy是尼罗罗非鱼的雄性性别决定基因,在没有amh的情况下,amhy可以补偿amh在卵泡发育和精子发生中的功能,而amh△-y由于去功能化在卵泡发育和精子发生中丧失了其功能。本研究为解析复制基因的功能互补或冗余提供了一个良好案例,既丰富了对amh基因在硬骨鱼类,乃至在脊椎动物雌雄生殖中的认知,也为可育YY伪雌鱼的培育和YY维持系的建立奠定了基础,在遗传全雄罗非鱼的规模化生产中有广阔的应用前景。