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microRNA是一种小的非编码RNA,在细胞内具有多种重要的调节作用。其中,miR-22在猪不同肉色的肌肉中差异表达,可能通过靶向ELOVL6调控肌肉细胞脂肪酸组成及线粒体功能,是影响肉品质性状的一个潜在分子机制。本研究以C2C12成肌细胞为主要研究对象,探究miR-22和ELOVL6对骨骼肌细胞脂肪酸组成和线粒体功能的影响,并在HEK293t细胞中研究确定miR-22和ELOVL6之间的靶向关系,然后通过分离猪骨骼肌卫星细胞,进一步探究miR-22和ELOVL6在猪肌肉中的靶向关系。主要的研究结果如下:1、miR-22对C2C12细胞脂肪酸组成、线粒体功能的影响将合成的miR-22模拟物(miR-22 mimics)以及抑制剂(miR-22 inhibitor)分别转染至C2C12细胞中,转染24 h后收集细胞。气相色谱结果显示,过表达miR-22后细胞中棕榈酸(C16:0)的相对含量显著上调(P<0.05),油酸(C18:1)的相对含量极显著下调(P<0.01),亚油酸(C18:2)的相对含量显著下调(P<0.05)。JC-1结果显示,过表达miR-22导致细胞线粒体膜电位显著下降(P<0.05)。此外,电镜观察结果发现,细胞线粒体出现大量空泡样损伤,异常嵴的线粒体占比极显著上升(P<0.01),线粒体的平均环形度极显著上调(P<0.01)。进一步检测相关标志基因的表达发现,过表达miR-22后细胞中过氧化物体增殖激活受体α(Peroxisome proliferators-activated Receptorα,PPARα)、细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)、蛋白磷酸酶2B(Protein Phosphatase 2B,PP2B)、核呼吸因子(Nuclear respiratory factor 1,NRF1)和转铁蛋白受体(Transferrin receptor 1,Tf R1)的表达量显著下调(P<0.05)。而抑制miR-22的结果均与以上结果相反。2、miR-22与ELOVL6基因间的靶向关系鉴定构建含有miR-22结合位点的Psicheck2-ELOVL6双荧光素酶报告载体和突变载体,分别与miR-22 mimics及阴性对照(NC)共转染至HEK293t细胞中。荧光素酶活性报告显示,过表达miR-22后荧光素酶活性被极显著抑制(P<0.01)而突变组中没有发现荧光素酶活性的显著变化(P>0.05)。此外,将miR-22 mimics和inhibitor分别转染至C2C12细胞中,24 h后收集细胞,检测ELOVL6基因的表达情况。q-PCR和WB结果显示,过表达miR-22后ELOVL6基因的m RNA表达量极显著下调(P<0.01),蛋白表达量也显著下调(P<0.05),而抑制miR-22的结果相反。3、ELOVL6对C2C12细胞脂肪酸组成、线粒体功能的影响构建ELOVL6基因的pc DNA3.1过表达载体和Si RNA干扰载体,分别转染至C2C12细胞中,转染24 h后收集细胞。干扰ELOVL6基因表达后,q-PCR和WB结果显示,ELOVL6的m RNA表达量极显著下调(P<0.01),蛋白表达量显著下调(P<0.05)。气相色谱结果显示,干扰ELOVL6基因表达后,细胞中棕榈酸(C16:0)的相对含量显著上调(P<0.05),油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)的相对含量显著下调(P<0.05)。结果显示,干扰ELOVL6基因表达导致细胞线粒体膜电位显著下降(P<0.05),细胞线粒体出现大量空泡样损伤,异常嵴的线粒体占比显著上升(P<0.05),线粒体的平均环形度极显著上调(P<0.01)。干扰ELOVL6基因表达后,PPARα、Cyt C和PP2B的表达量显著下调(P<0.05),NRFl和Tf R1极显著下调(P<0.01)。过表达ELOVL6基因后的结果均与以上结果相反。将miR-22 mimics与ELOVL6过表达载体共转染至C2C12细胞进行修复实验。结果显示,共转染组中细胞脂肪酸的含量、线粒体膜电位和形态及相关标志基因的表达量与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。4、miRNA-22对猪骨骼肌卫星细胞ELOVL6基因表达的影响通过酶消化法分离猪骨骼肌卫星细胞,免疫荧光鉴定结果显示,骨骼肌卫星细胞特异性标记蛋白PAX7在细胞核中呈阳性表达,Desmin在细胞质中呈阳性表达。将合成的miR-22 mimics和inhibitor分别转染至猪骨骼肌卫星细胞中,24 h后收集细胞。q-PCR结果显示,过表达miR-22后ELOVL6基因的m RNA表达量极显著下调(P<0.01),而抑制miR-22后结果相反。综上所述,本研究得出以下结论:(1)在C2C12细胞中,miR-22可以通过靶向ELVOL6调控细胞脂肪酸组成。(2)在C2C12细胞中,miR-22可以通过靶向ELOVL6调控细胞线粒体功能。(3)在猪骨骼肌卫星细胞中,miR-22同样可以调控ELOVL6基因的表达。