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研究背景及目的:长期乙型肝炎病毒感染可能产生不良后果包括:肝功能失代偿、肝硬化和肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)。作为全球性健康问题,慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染仍然缺乏有效的治疗措施,每年因HBV感染导致的死亡人数仍将近1百万。2016年全球感染患者约有2.92亿人,感染患者主要分布于亚洲和非洲(亚洲占63.8%,非洲占27.6%)。其中仅在我国的慢乙肝感染患者人数就已达到1亿,由此所带来的经济负担和社会负担不容小觑。在乙型肝炎病毒慢性感染过程中,乙型肝炎病毒与肝细胞、宿主免疫系统三者之间的动态变化导致感染处于不同的阶段。HBV感染过程主要分为以下四个阶段:免疫耐受期(慢性HBV携带状态)、免疫清除期(HBe Ag阳性CHB)、免疫控制期(非活动HBs Ag携带状态)和再活动期。为实现世界卫生大会所提出的“在2030年全面消除乙型肝炎病毒感染”的目标,根据乙型肝炎病毒感染的不同阶段,对不同阶段慢性乙型肝炎病毒感染患者提供更精准化治疗。乙型肝炎患者由于长期慢性感染引起机体反复炎症刺激,免疫细胞通过各种途径激活肝星状细胞增殖、分化,进而引起细胞外基质的沉积。细胞外基质沉积是引起肝脏纤维瘢痕形成和肝内结构重建的主要病理改变。使用抗核苷酸类药物、乙肝疫苗接种等治疗方案降低了乙型肝炎患者DNA病毒拷贝量、改善了患者肝功能。然而经过治疗后肝功能恢复正常的患者中依然存在发生肝脏纤维化甚至肝癌的风险。因此,本研究目的在于探究在无症状乙肝携带者(Asymptomatic Hepatitis B Antigen Carrier,ASC)和经治肝功能正常患者(Chronic Hepatitis B,CHB)中,肝炎爆发过程是否影响DNA转录水平进而导致两者预后的差异。研究方法:分离ASC患者与经治CHB患者的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)并提取总RNA。利用Arraystar(人Lnc RNA/m RNA表达微阵列)芯片测序分析两组患者之间的差异的m RNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)。随后通过KEGG分析差异基因和肝脏纤维化、肝癌发生发展相关通路,根据分析结果筛选出经治CHB患者中上调表达的m RNA和相关的lnc RNA,并进一步扩大样本量进行验证。利用磁珠分选PBMC以进一步确定lnc RNA来源。同时通过分离细胞质与细胞核,鉴定lnc RNA的核质比例并通过病毒刺激Thp1(人外周血单核细胞系)细胞以明确HBV病毒颗粒与lnc RNA的关联。根据lnc RNA定位和核质比例分布,设计相应的si RNA(Small interfering RNA)和慢病毒载体用于敲低和过表达巨噬细胞中目的lnc RNA,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中TGF-β1的变化。最后,将Thp1细胞与Lx-2(人肝星状细胞)共培养,利用定量聚合酶链式反应(q-PCR)和蛋白质印记(Western Blot)观察巨噬细胞对肝星状细胞的影响。同时利用免疫荧光染色技术标记LX-2细胞中α-SMA(Smooth Muscle Actin)和I型胶原蛋白酶(Collagen I),在共聚焦显微镜下观察并统计细胞的荧光强度。研究结果:通过分析芯片结果,我们筛选得到1254个差异表达的m RNA,其中在CHB中上调表达的有630个基因,下调表达的有624个基因。KEGG分析上调表达的差异基因在TGF-β通路中显著富集。经过q-PCR方法扩大样本量验证提示,Smad4和TGF-β1的表达在CHB患者PBMC中显著升高。在血浆中,CHB患者TGF-β1(Transforming growth factor-β1)的水平显著高于ASC组。与此同时,CHB组PBMC中胞内Smad4水平显著高于ASC组。根据关联分析,我们筛选得到与Smad4相关联的lnc RNA。该lnc RNA(ENST00000519726)在CHB患者CD14~+细胞胞质中高表达,我们将之命名为HEIM(Highly Expressed in Monocyte)。经过HBV病毒刺激之后,Smad4和TGF-β1表达量伴随着HEIM表达量上调而出现上调。另外我们在巨噬细胞系Thp1中进一步验证发现,敲低HEIM表达量能够显著降低细胞内Smad4、TGF-β1的m RNA水平和蛋白水平,同时也能够显著下调上清液中的TGF-β1水平。利用慢病毒感染巨噬细胞来构建lnc RNA稳定过表达的THP1细胞系,发现过表达HEIM能够上调Smad4和TGF-β1的m RNA水平进而促进其蛋白表达水平。将Thp1与LX-2共培养,沉默内源性HEIM后的Thp1细胞使LX-2中Collagen I和α-SMA的表达量下调。同时,过表达HEIM后的Thp1细胞使LX-2中Collagen I和α-SMA的表达量上调,并且共聚焦显微镜提示LX-2中Collagen I和α-SMA的荧光强度显著高于对照组。研究结论:以上研究表明,lnc RNA异常表达是影响肝炎经治患者预后的因素之一。通过q-PCR技术,我们筛选得到了在经治患者中高表达的lnc RNA。该lnc RNA高表达于外周血CD14~+巨噬细胞中,且主要位于细胞胞质中。过表达lnc RNA能促进细胞因子TGF-β的分泌,进而诱导肝星状细胞LX-2活化。相比于长期肝功能正常的乙肝携带者,经过抗病毒治疗后肝功能正常的慢乙肝患者发生肝纤维化的风险更高。综上所述,在乙型肝炎病毒长期存在反复造成肝损伤的过程中,即使经过药物治疗后肝功能恢复正常,患者仍需积极进行抗纤维化治疗。利用RNA干扰技术调节经治患者巨噬细胞HEIM水平可以作为日后改善乙型肝炎患者预后的措施之一。