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龋病是常见的由细菌引起的一种感染性疾病,严重危害到人们的口腔健康水平。本研究组经过多年的研究,表明DNA疫苗可以有效预防龋病,并研制出含靶向蛋白CTLA-4和抗原特异性序列GLU的靶向DNA疫苗pGJGLU。但该DNA疫苗究竟如何发挥作用,对免疫反应的类型会产生怎样的影响,以及CTLA-4及其配体B7-1及B7-2分子在该疫苗引起的免疫反应中的作用如何尚需进一步探索。为此,我们进行了初步研究,希望明确B7-1及B7-2分子对免疫类型的影响,及其对该疫苗发挥作用的影响。实验一 B7分子的敲除对防龋DNA疫苗影响作用的研究目的:利用B7-1及B7-2基因敲除鼠研究两分子对防龋DNA疫苗的体内防龋效果的影响。方法:采用B7-1、B7-2基因敲除小鼠(分别记为B7-1 KO组、B7-2 KO组、B7-1/2KO组)及野生型小鼠(WT组),用已构建成功含靶向蛋白CTLA-4和抗原特异性序列GLU的靶向DNA疫苗pGJGLU,经鼻腔免疫各组小鼠,并在免疫前(OW)和第一次免疫之后的第2、4、6、8、10、12、14和16周分别采集各组小鼠的唾液及血清样本。用ELISA的方法来检测收集到的各组小鼠在不同的时间点的血液和唾液中致龋蛋白GLU的抗体水平。结果:B7-1/2KO组与对照组进行比较,其小鼠的唾液样本和血清样本中的针对蛋白GLU的抗体IgG和IgA的含量均有不同程度的降低,并且从实验结果中可以看出IgA于第6周时含量最高,晚了 2周。血清样本内的抗GLUIgG的含量在各个时间点上亦均低于对照组。且进行数据分析后发现B7-1/2 KO组在除了第4、14与第16周以外的其他所有时间点均有统计学意义。B7-1 KO组与对照组比较发现,其IgA抗体在各个研究时间点的检测含量有显著地减少,差异仅在免疫前及免疫后的第2、6和8周具有统计学意义。并且从实验结果中可以看出IgA于第6周时含量最高,晚了 2周。该组的血清样本中IgG抗体在各个时间均较对照组低,且差异仅在免疫前及免疫后的第2、4、8和10周具有统计学意义。B7-2 KO组相对于对照组唾液内IgA抗体的减少则只在第6周具有统计学意义,其血清内IgG抗体的减少,则只在第10周具有统计学意义,而其余时间点均未观测到显著性差异。结论:B7-1及B7-2分子的存在可促进免疫靶向防龋DNA疫苗后唾液及血液内特异性抗体的产生,对于疫苗发挥免疫效力具有重要作用。其中B7-1分子的作用强于B7-2分子。实验二不同B7分子的敲除对接种DNA疫苗后体内免疫反应类型的不同影响目的:研究B7-1,B7-2分子在靶向防龋DNA疫苗诱导的体内免疫反应过程中作用及其对诱导产生的免疫反应类型的影响。方法:采用B7-1、B7-2基因敲除小鼠(分别记为B7-1 KO组、B7-2 KO组、B7-1/2KO组)及野生型小鼠(WT组),并用靶向防龋DNA疫苗pGJGLU于小鼠股四头肌处以肌肉注射的方法免疫各组小鼠,2周加强免疫一次。一周后取出并采用尼龙网碾磨的方法获取各组小鼠的脾细胞,而后将蛋白GLU加入脾细胞内。培养48小时后,小心收集各个实验组的上清并采用ELISA的方法检测评价各组样本内中细胞因子如IL-17、IFN-γ、IL-10等的含量。结果:B7-2KO组与对照组进行比较,可发现其样本中检测到的IFN-γ的含量增加,表明B7-2可以抑制细胞因子IFN-γ的合成分泌。各基因敲除组IL-17的分泌水平没有明显变化,提示IL-17的分泌与B7-1及B7-2分子没有明显联系。B7-1/2 KO组与对照组比较,发现其样本中检测到的IL-10的含量没有明显改变,而B7-2 KO组与B7-1 KO组则有不同程度的增加。这提示了 IL-10的分泌可以不依赖B7-1/2分子的同时存在。结论:B7分子对该DNA疫苗所引起的免疫调节是错综复杂的,而在B7-1、B7-2分子之间其作用亦不相同。B7-2分子可以抑制Th1型免疫反应;B7-1及B7-2分子对Th17型的免疫反应没有明显影响。实验三B7分子对T淋巴细胞增殖分化的作用研究目的:利用基因敲除鼠研究共刺激分子B7-1、B7-2对T淋巴细胞的增殖及分化方面的影响。方法:采用B7-1、B7-2基因敲除小鼠(分别记为B7-1 KO组、B7-2 KO组、B7-1/2KO组)及野生型小鼠(WT组),解剖分离各个实验组小鼠的股骨和胫骨,并从中得到骨髓细胞。体外条件下培养细胞并诱导获得DC。采用LPS刺激DC成熟,并在对成熟DC进行去增殖处理后,使其与T淋巴细胞进行共培养,并分成两组。一组收集共培养的细胞悬液后,采用CCK8试剂盒来做关于T淋巴细胞增殖情况的检测评价;另一组则在培养之后将细胞与培养液分别收集起来,分别分析T细胞IFN-γ、IL-4、IL-17、GATA-3、T-bet及RORγt的基因转录情况与细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的分泌情况。从细胞中提取到总RNA,并于逆转录后进行荧光定量PCR的检测。而培养上清液,则采用ELISA试剂盒进行检测。结果:B7-1KO组的检测结果显示与对照组比较,其上清及细胞内表达的IFN-y,T-bet均有降低,IL-4,GATA-3则均有升高,而IL-17及RORyt则无明显变化;B7-2KO组检测结果显示与对照组比较,其上清及细胞内表达的IFN-γ,T-bet升高,而IL-4,IL-17,GATA-3与RORγt则均有一定程度的降低;B7-1/2 KO组的检测结果则显示在与对照组比较时,无论其上清还是细胞内表达的各因子的变化程度均位于B7-1 KO组与B7-2 KO组的变化之间。另外关于增殖的检测则显示各个实验组之间均无明显差异。结论:B7-1与B7-2分子对于T淋巴细胞的作用不同。前者可以促使初始细胞向Th1细胞方向进行分化,阻碍其向Th2细胞方向分化,而与Th17细胞的分化并没有明显的联系;而后者即B7-2分子则可以促使初始细胞向Th2与Th17细胞方向进行分化,并阻碍其向Th1细胞方向分化.另外研究结果显示B7-1及B7-2分子与T细胞的增殖之间并没有明显的联系。