目的:本课题拟采用性状、显微、分子鉴定相结合的方法对大量涌入中国市场的加拿大海参(叶瓜参Cucumaria frondosa)进行基源鉴定,为样品质量可控奠定基础。以叶瓜参为原料,采用现代提取、分级纯化技术,拟优化制备出叶瓜参酸性多糖(Sulfated polysaccharides from Cucumaria frondosa,CFP)的最佳制备工艺。应用现代分析仪器技术,对CFP的化学组成及结构进行系统表征,阐明其初级结构,为CFP的质量控制提供依据。在上述研究基础上,探讨CFP是否具有缓解肾间质纤维化的作用,并阐明其作用机制。本课题的研究旨在完善叶瓜参的样本信息,保障叶瓜参样品的可控性,控制CFP的质量,提高叶瓜参的经济效益,带动叶瓜参相关产业的发展,推进叶瓜参的资源开发,亦为肾间质纤维化的防治提供新思路。方法:1.叶瓜参的基源鉴定采用性状、显微、分子鉴定相结合的方法对市售加拿大海参进行品种鉴定,验证其是否为叶瓜参,并对其性状及显微进行描述。2.叶瓜参多糖的制备采用超声辅助提取法提取叶瓜参粗多糖,并对工艺条件进行优化。采用DEAE-纤维素-52阴离子交换柱色谱与Sephadex G100凝胶柱色谱联合应用的方法对CFP进行分级纯化,获得离子电性和分子量较均一的纯化多糖。通过测定硫酸基及糖醛酸的含量筛选后续实验应用的叶瓜参酸性多糖(CFP)。3.叶瓜参酸性多糖的化学组成及结构鉴定通过综合采用苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法、氯化钡-明胶法、硫酸-咔唑法、糖腈乙酸酯衍生物-气相色谱法、分子排阻高效液相色谱法、紫外光谱、红外光谱、甲基化反应、质谱、核磁共振波谱等技术方法对制备的纯化多糖CFP的化学组成及结构进行系统解析。4.叶瓜参酸性多糖缓解肾间质纤维化的作用研究应用肾间质纤维化模型(小鼠单侧尿道阻塞模型,UUO模型)探讨CFP对肾间质纤维化的干预作用。通过测定尿液中尿蛋白的含量、血清中尿素氮和肌酐的含量评价肾功能;应用苏木素-伊红(H&E)、Masson染色法观察肾脏的病理学变化、炎症浸润、计算胶原面积等;通过测定肾组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量评估炎症因子的变化;采用免疫组化染色测定肾组织中转化生长因子β1蛋白(TGF-β1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、肌动蛋白α(α-SMA)、纤连蛋白(Fibronectin)、钙粘附蛋白E(E-cadherin)、Ⅰ型胶原(CollgenⅠ)和Ⅳ型胶原(Collgen Ⅳ)的含量。5.CFP缓解肾间质纤维化的作用机制研究采用体内与体外机制相结合的研究方法,应用PCR、Western Blot等技术测定肾脏组织及HK-2细胞中PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白的表达情况。成果:1.叶瓜参的基源鉴定性状、显微、分子鉴定结果均表明市售加拿大海参为棘皮动物门,海参纲,枝手目,瓜参科叶瓜参(Cucumaria frondosa)的干燥体,与文献及市场调研结果一致。叶瓜参的腹面和五条内筋均为橙红色或金黄色,此为其性状独有特征。叶瓜参的显微结构中,体壁的骨片为不同大小的穿孔板。2.叶瓜参多糖的制备超声辅助提取法提取叶瓜参粗多糖的最佳工艺条件为:液料比(mL:g)为22:1;提取时间为30min;提取温度为62℃;超声功率为120W。此条件下,叶瓜参粗多糖提取率为11.72±0.09%。经DEAE-纤维素-52阴离子交换柱色谱和Sephadex G100凝胶柱色谱联合应用对叶瓜参多糖进行分级纯化,得到2个离子电性及分子量均较为均一的组分,分别为P-1及P-2。由于P-2中硫酸基及糖醛酸含量更高,因此将其选为后续实验中所应用的叶瓜参酸性多糖(CFP)。3.叶瓜参酸性多糖的化学组成及结构鉴定CFP为酸性多糖,其总糖含量为58.57±0.51%,蛋白质含量为1.20±0.08%,硫酸基含量为21.57±1.09%,糖醛酸含量为5.58±0.16%。CFP的相对粘度为1.16,CFP是由岩藻糖构成的均多糖,相对分子质量为136 kDa。CFP的糖残基主要为:SO3--O-4-α-L-Fucf-(1→、→3)-α-L-Fucf-(1→、→2 SO3-,3)-α-L-Fucf-(1→、→3,4 SO3-)-α-L-Fucf-(1→及→2 SO3-,3,4 SO3-)-α-L-Fucf-(1→。4.叶瓜参酸性多糖缓解肾间质纤维化的作用研究与假手术组相比,UUO模型组的小鼠肾功能指标异常,血肌酐、血尿素氮、尿蛋白均显著增加;H&E染色可观察到大量炎症细胞积聚;炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的水平剧增,TGF-β1、FGF2、α-SMA、Fibronectin、Collgen Ⅰ、Collgen Ⅳ表达增强。而采用CFP干预后,显著改善了小鼠肾功能质变,炎症因子表达减少,TGF-β1和FGF2表达减少,ECM的合成减少,肾脏的炎症和纤维化均有所改善。同时,CFP抗炎和抗纤维化的作用呈剂量依赖性。5.叶瓜参酸性多糖缓解肾间质纤维化的作用机制在UUO模型中,CFP能抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白及下游炎症因子与促纤维化因子的表达。在TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化模型上,CFP能够显著抑制TGF-β1引起的PI3K/AKT/NF-κB通路相关蛋白及磷酸化蛋白的高表达,使用PI3K的抑制剂3-MA进行干预,其与CFP联合使用对PI3K/AKT/NF-κB的抑制有增效作用。结论:本文以市售加拿大海参为研究对象,应用性状、显微、分子鉴定的方法验证其基源为叶瓜参(Cucumaria frondosa),三种方法均可作为后续研究中鉴定叶瓜参基源的方法。采用单因素及响应面优化的方法对超声辅助提取法进行优化,提取率显著由于传统热水提取法;采用DEAE-纤维素-52和Sephadex G100柱色谱联合应用可获得离子电性和分子量均较为均一的2个纯化组分。通过化学分析、UV-Vis、FTIR、GC、甲基化-GC-MS、NMR等技术初步鉴定出CFP的一级结构。通过建立UUO模型发现CFP具有缓解肾间质纤维化的作用效果,通过体内、体外机制研究验证了CFP能够通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路的转导来缓解肾间质纤维化。本研究也为叶瓜参样品的可控性奠定基础,为叶瓜参多糖的制备及质量控制提供了理论基础,为叶瓜参资源综合开发应用提供实践基础,为肾间质纤维化的防治提供新思路。