论文部分内容阅读
1,2,4-丁三醇(1,2,4-Butanetriol,BT)是一种重要的有机合成中间体,广泛应用于军工、医药、烟草、化妆品、造纸、农业和高分子材料等领域。目前丁三醇的生产主要采用硼氢化钠(NaBH4)还原苹果酸二酯或铷和碳催化苹果酸加氢等化学合成法。这些方法反应条件苛刻、环境污染严重、收率低、提纯难度大。虽然生物转化法可以克服以上缺点,但是其转化率较低。本实验室前期构建了能够将木糖转化为D-1,2,4-丁三醇的重组菌株。为进一步提高重组菌株的合成效率,论文在重组菌株培养条件优化的基础上,对菌株代谢系统进行了优化,主要结论如下:考察了培养条件对重组菌株合成D-1,2,4-丁三醇的影响,10%接种量转接,33oC培养,转接6h后诱导,转接时添加5g/L葡萄糖添加碳酸钙控制pH,250mL锥形瓶装液量50m L等条件是适宜的摇瓶发酵条件。探讨了能源供给、碳源利用方式与D-1,2,4-丁三醇合成的关系。碳源的合理添加可以促进D-1,2,4-丁三醇合成。敲除ptsG基因改造重组菌株的磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖转移酶系统(PTS),菌株可在利用葡萄糖生长的同时进行木糖的转化。敲除编码甲基乙二醛合酶的基因mgsA,菌株可同时转运两种碳源,在底物浓度20g/L的情况下,丁三醇产量可达9g/L,转化率约为64%。在mgsA缺陷型工程菌中木糖利用与葡萄糖代谢相协调。研究了D-1,2,4-丁三醇合成途径代谢通量调控对D-1,2,4-丁三醇合成的影响。在对丁三醇发酵过程分析的基础上,考察了来自新月柄杆菌的木糖酸内酯酶xylC、木糖酸脱水酶xylD对工程菌产D-1,2,4-丁三醇的影响。单独引入xylC,虽有效水解了木糖酸内酯,但加速了木糖酸的积累,不利于D-1,2,4-丁三醇的合成。同时引入xylC、xylD,木糖酸的积累明显变少,D-1,2,4-丁三醇产量也提高到了7.9g/L;而单独引入xylD,D-1,2,4-丁三醇产量显著提高,由对照组MJ133k-1的7.6g/L提高到8.8g/L。这些结果表明丁三醇合成途径中各反应步骤反应能力差异限制了D-1,2,4-丁三醇的高效合成。xylC的引入将木糖酸-γ-内酯自发水解变为酶水解,xylD的引入则使D-1,2,4-丁三醇合成途径具备了专一性的木糖酸脱水酶,完善了D-1,2,4-丁三醇合成途径。初步探讨了NADH与丁三醇合成的关系。敲除乳酸脱氢酶基因ldhA减少竞争性消耗NADH的副产物乳酸生成后,虽然发酵48h后二者产量基本相同,但12h时丁三醇生成量约是对照组MJ133k-1的2倍,这暗示NADH与丁三醇的合成有密切关系。