论文部分内容阅读
恶性肿瘤严重威胁全球人类健康。由于肿瘤的发生发展具有多元性及复杂性，认识肿瘤发生发展机制和寻找治疗肿瘤方法成为遏制肿瘤面临的巨大挑战。肿瘤免疫疗法是继手术、化疗、放疗后第四大有效的抗肿瘤疗法。近年来，作为B7免疫球蛋白超家族的新成员，共刺激分子B7-H3在多种肿瘤组织异常高表达，并与肿瘤的生物学特性密切相关，被认为可能是一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点。目的：本课题旨在通过检测人食管鳞癌组织、相应癌旁正常组织及食管鳞状上皮不典型增生组织中B7-H3分子的表达，分析其与患者临床病理因素以及术后生存时间之间的关系。检测食管癌细胞株TE-1、TE-13、Eca-109细胞中B7-H3的表达，并通过靶向干扰B7-H3基因表达来研究B7-H3对食管癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响。方法：1用免疫组织化学法检测食管鳞癌组织、癌旁正常组织及食管鳞状上皮不典型增生组织中B7-H3蛋白的表达以及CD8+T淋巴细胞的浸润程度。2用RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）方法检测食管癌细胞株TE-1、TE-13、Eca-109中B7-H3的表达情况。3用RT-PCR、Western Blot等方法检测B7-H3siRNA基因沉默后Eca-109细胞中B7-H3的mRNA和蛋白表达情况。4通过MTT实验分析沉默B7-H3后食管癌细胞的增殖活性。5通过划痕实验分析沉默B7-H3后食管癌细胞的迁移运动能力。6通过Transwell实验分析沉默B7-H3后食管癌细胞的侵袭能力。结果：1免疫组化结果显示，B7-H3阳性着色主要定位在肿瘤细胞的细胞质和细胞膜。在82例ESCC患者中，B7-H3阳性率为98.8%。癌旁正常组织和食管鳞状上皮不典型增生组织呈弱表达或不表达。食管癌组织中B7-H3表达水平与患者性别、肿瘤大小、淋巴结转移等差异均无统计学意义（P>0.05）；与患者的年龄、肿瘤浸润深度、TNM分期差异有统计学意义（P <0.05）。随着患者肿瘤浸润深度的增加，B7-H3的表达水平增加；临床TNM分期越晚，B7-H3的表达越高。CD8免疫组化染色结果显示，在82例食管癌组织中，CD8+T淋巴细胞低度浸润36例，高度浸润46例，与食管癌组织中B7-H3的表达水平呈负相关（P=0.003）。2RT-PCR结果显示B7-H3在食管癌细胞TE-1（0.382±0.008）、TE-13（0.399±0.008）、Eca-109（0.428±0.012）中组成性表达，均属于中低表达水平。其中Eca-109细胞中B7-H3的表达略高于其在TE-1、TE-13中的表达水平，但差异无统计学意义。3RT-PCR结果显示，与未转染组（0.5403±0.0129）、转染空载体组（0.5324±0.0072）相比，转染B7-H3siRNA质粒48h可以使Eca-109细胞中B7-H3mRNA表达水平（0.1285±0.0017）降低（P<0.01）。未转染组与转染空载体组相比，差异没有统计学意义。4Western Blot结果显示，转染B7-H3siRNA基因48h后，Eca-109细胞中B7-H3蛋白表达水平（0.4214±0.0048）显著低于未转染组（0.4921±0.0148）及空转染组（0.5006±0.0129）的B7-H3蛋白表达（P<0.05）。未转染组与空转染组相比，差异没有统计学意义。5MTT分析结果显示，转染后的Eca-109细胞接种于96孔板24h、48h、72h后，转染B7-H3siRNA的Eca-109细胞与空转染及未转染细胞相比，增殖率差异无统计学意义（P＞0.05），说明B7-H3siRNA基因转染对细胞增殖能力无显著影响，差异无统计学意义。6划痕实验结果显示，未转染组及空转染组的Eca-109细胞24h后向划痕边缘爬行的速度快，细胞铺展迅速，划痕的宽度明显变窄，有些细胞已经爬行至划痕的中央。而转染B7-H3siRNA的Eca-109细胞向划痕边缘爬行的速度明显减慢，划痕缺损处修复缓慢。经统计后发现，B7-H3siRNA转染组与未转染组及空转染组相比，划痕间距明显缩短，差异具有统计学意义（P<0.05）。提示转染B7-H3siRNA后，Eca-109细胞的平面运动能力明显下降。7Transwell侵袭小室实验结果显示，转染B7-H3siRNA后，通过人工基底膜的Eca-109细胞的数降低了大约50%。与未转染及空转染组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。可见沉默B7-H3后，Eca-109细胞的体外侵袭能力明显减弱。未转染组与空转染组相比，差异没有统计学意义（P>0.05）。结论：1共刺激分子B7-H3在人食管癌组织中过度高表达，与肿瘤的进展、患者预后密切相关，有望成为监测食管癌进展的重要指标。2B7-H3在食管癌中的表达与CD8+T淋巴浸润程度呈负相关，可能参与肿瘤的免疫逃逸。3沉默B7-H3基因能显著降低Eca-109细胞的迁移、侵袭能力，提示B7-H3基因可能参与调节食管癌的侵袭转移能力，为免疫治疗提供潜在的治疗靶点。