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背景肝衰竭是临床常见的严重肝病症候群,病情严重、并发症多、治疗困难,在我国病死率高达60～80%。我国肝衰竭的病因主要为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染,目前临床表现主要以慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)为主。在我国急性肝衰竭(acute liver failure,AHF)和亚急性肝衰竭呈现减少趋势,而慢加急性肝衰竭和慢性肝衰竭呈增加趋势。HBV 相关慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure,H-A)的发病过程中,机体针对HBV的特异性免疫和非特异性免疫状态,与其他慢性HBV感染状态相比,发生了很大的变化。其中机体体液免疫方面也发生了很多的变化,如在H-A患者体内其表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)水平较慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)低,并且发生了 HBeAg/抗HBe的血清学转换,甚至在很多患者体内会出现自身抗体谱转阳的情况。研究中发现在慢性HBV感染过程中出现了大量自身抗体的转阳,包括抗核抗体、抗线粒体抗体、抗平滑肌抗体等。其中抗可溶性肝抗原抗体(anti-soluble liver antigen antibody,anti-SLA/抗SLA)是肝抗原自身抗体的类型之一,有研究表明抗SLA在CHB、代偿性肝硬化、非代偿性肝硬化、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、急性肝衰竭(acute liver failure,AHF)中的阳性率分别为2.2%、3.5%、1.7%、2.6%、21.9%。但是,目前还没有关于抗SLA在H-A中的研究,而且为什么肝衰竭的患者中自身抗体表达上调,其机理也不清楚。抗体的产生是精细而复杂的过程。滤泡辅助性T细胞(Follicular T helper cells,Tfh细胞)辅助B细胞分化为浆细胞、产生抗体、及抗体类别转换。二者相互作用,在体液免疫应答中发挥重要作用。研究显示在自身免疫疾病中,Tfh细胞及其亚群频数发生变化,同时B细胞处于功能失调状态。在生发中心(Germinal Center,GC)的滤泡调节性 T 细胞(FollicularTregulatory cells,Tfr细胞),主要参与生发中心的反应,抑制Tfh细胞和B细胞,避免自身抗体的产生,与自身免疫性疾病相关。因此本文旨在研究Tfr细胞对H-A患者血浆抗SLA异常表达的影响。目的本研究是以HBV感染自然史的横向人群为研究对象,主要研究H-A患者表达自身抗体SLA的程度,以及高表达抗SLA与Tfr细胞频数和功能的关系。方法1.研究对象26例H-A为本院及广州市第八人民医院2015年3月至2016年2月的门诊或住院患者,其中男21例,女5例。所有病例的诊断符合2012年《肝衰竭诊治指南》的诊断标准。另对照组中包括16例CHB患者,男15例,女1例;代偿性肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者17例,男15例,女2例;14例在院进行健康体检(health control,HC)各型肝炎血清学标志物阴性及肝功能正常的人群作为健康对照组。CHB及LC的诊断均符合2015年《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准。入选的研究对象均排除以下情况:合并感染甲型肝炎病毒(hepatitis a virus,HAV),丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,HCV),丁型肝炎病毒(hepatitis d virus,HDV),戊型肝炎病毒(hepatitis e virus,HEV)或人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV);合并糖尿病、甲状腺功能亢进、自身免疫性肝病等自身免疫性疾病;合并恶性肿瘤及其他严重代谢性疾病。所有研究对象均签署知情同意书。1.血浆中抗SLA水平采用ELISA方法检测HC、CHB、LC、H-A组患者血浆中的抗SLA的OD值。并且将该值与肝功能相关指标进行相关性分析。2.外周血Tfr细胞频数及相关表型分子表达情况利用流式细胞染色技术,检测慢性HBV感染者外周血Tfr细胞频数及表型分子GITR、CTLA-4的表达情况。比较各组间Tfr细胞频数及表型差异。3.血浆中相关细胞因子水平采用流式多因子检测(CBA)方法,检测各组血浆中的相关细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10、GranzymeA、GranzymeB)水平。比较各组及 H-A 组内的细胞因子浓度大小及平均荧光密度(MFI)。同时将HBV感染者血浆中相关细胞因子及抗SLA的OD值与Tfr细胞频数进行相关性分析。4.外周血Tfr细胞分泌细胞因子水平利用流式细胞内因子染色(ICS)技术,检测慢性HBV感染者外周血Tfr细胞在CD3和CD28刺激情况下,分泌细胞因子(GranzymeA、GranzymeB、IL-10、IL-21 和 TNF-α 及 IFN-γ)水平。5.统计分析计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示,两组间计量资料间采用两独立样本t检验,不满足方差分析条件采用Mann-Whitney U test及Spearman进行相关性分析。所有数据采用Graphpad Prism 5.0及SPSS 20.0进行处理及作图。所有的统计分析基于双侧假设检验,以α =0.05为检验水准,P<0.05有统计学意义。结果1.慢性HBV感染组血浆中的抗SLA水平均显著高于HC组(P<0.001),而H-A组抗SLA的OD值显著高于CHB(P<0.001)、LC组(P<0.001);在HBV感染者中,抗SLA的OD值大小与ALT(R=0.260,P=0.046)及TBIL(R=0.646,P<0.001)呈正相关,与 HBV-DNA 无明显相关(R=-0.069,P=0.598)。在H-A组,抗SLA的OD值大小与总胆酸(TBA)呈正相关(R=0.478,P=0.024),与凝血酶原活动度(PTA)、ALT、AST、DBIL、TBIL无显著相关性。2.慢性HBV感染者外周血CD4+T细胞频数无显著性差异,H-A组中的Tfr 细胞频数明显低于 HC(P<0.001)、CHB(P<0.001)、LC(P<0.001),H-A组中的 Tfh 细胞频数明显低于 HC(P<0.001)、CHB(P<0.010)、LC(P<0.001),且在 H-A 组中的 Tfr/Tfh 明显低于 HC(P<0.001)、CHB(P<0.001)、LC(P<0.001)。H-A患者外周血中Tfr细胞的两种主要功能表型(GITR和CTLA-4),CTLA-4的表达明显高于GITR(P<0.050),但是HBV感染者外周血中Tfr细胞表达两种表型无显著差异。3.H-A患者血浆中的2种细胞因子(IFN-γ、TNF-α)浓度明显高于CHB(P<0.050,P<0.001),GranzymeA 明显高于 HC(P<0.010)。而 IL-10 浓度明显高于 HC(P<0.001)、CHB(P<0.050)、LC(P<0.001)。而 GranzymeB 的水平没有显著差异。在H-A组内的5种细胞因子浓度无显著差异。H-A血浆中分泌的4种细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10、GranzymeA)MFI明显高于HC、CHB、或者LC,并且H-A组内血浆中5种细胞因子间的MFI均存在显著差异。4.慢性HBV感染者中Tfr细胞频数与血浆中IL-10水平呈负相关(R=-0.390,P=0.030),同时与血浆中分泌的抗SLA呈负相关(R=-0.450,P<0.010),而与 GranzymeA 及 GranzymeB 无显著相关。5.慢性HBV感染者PBMC经CD3/CD28刺激后,Tfr细胞相关的6种细胞因子(GranzymeA、GranzymeB、IL-10、IL-21、TNF-α 及 IFN-γ)无显著差异。H-A组内CD3/CD28刺激后,Tfr细胞相关的6种细胞因子(GranzymeA、GranzymeB、IL-10、IL-21、TNF-α 及 IFN-γ)也无显著差异。结论H-A患者的抗SLA水平表达显著增加,提示了在肝衰竭状态下患者体液免疫环境发生了变化。H-A患者Tfr细胞频数与抗SLA水平负相关,同时与相关细胞因子(IL-10)呈负相关,均提示了 Tfr细胞在H-A患者高表达SLA中发挥了重要作用。未来的体外研究将进一步验证这一结论。