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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus, PRRSV)引起的高度接触性传染病,主要引起妊娠母猪严重的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道疾病,已经成为对世界养猪业造成重大经济损失的疫病之一。2006年我国出现并流行以非结构蛋白2(Nsp2)编码区30个不连续氨基酸缺失为分子特征的高致病性PRRSV,造成以高热、高发病率和高死亡率为特征的严重型PRRS,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。目前为止,高致病性PRRSV毒株的致病性增强的分子机制尚不完全清楚。猪肺泡巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophages, PAMs)是PRRSV惑染的主要靶细胞,PRRSV感染对靶细胞造成的损伤和功能的改变是其致病的一个重要原因。本研究从PRRSV影响PAMs功能的角度入手,着重研究不同致病性PRRSV毒株对PAMs细胞因子表达的影响,并分析导致不同毒株诱导PAMs表达TNF-α差异的病毒蛋白,为阐明高致病性PRRSV致病性增强的分子机制奠定基础。首先分析了不同致病性PRRSV毒株对PAMs细胞因子表达的影响。分别用PRRSV高致病性毒株(JXwn06)和低致病性毒株(HB-1/3.9)感染PAMs,从mRNA专录和蛋白水平分析它们对PAMs细胞因子表达的影响。用荧光定量PCR检测感染AMs中白细胞介素(IL)-1β、IL-8、IL-10、干扰素(IFN)-α, IFN-β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的mRNA转录水平,并用ELISA检测细胞培养上清中的细胞因子。结果显示,促炎细胞因子IL-1β和IL-8无论是在mRNA还是蛋白质水平,两个毒株感染组之间均无统计学差异：两个毒株感染PAMs后都可下调上清中Ⅰ型干扰素的水平,无显著差异；同时,与低致病性毒株相比,高致病性毒株能诱导产生更高水平的IL-10,并抑制TNF-α的表达。提示：高致病性PRRSV感染在诱导宿主免疫抑制和拮抗宿主的抗病毒效应中具有重要作用。从不同致病性PRRSV毒株诱导TNF-α的差异表达角度入手,分析了引起PAMs TNF-α差异表达的病毒蛋白。同时,进一步运用反向遗传技术构建病毒蛋白编码区互换的嵌合病毒,证实了在诱导HMF-α差异表达中起关键作用的病毒蛋白。荧光素酶报告试验结果表明,Nsp7、Nsp11和Nsp12是不同致病性PRRSV毒株诱导TNF-α的mRNA差异表达的病毒蛋白。通过分析各个非结构蛋白对ERK信号通路的影响,结果发现高致病性PRRSV毒株的Nsp1β和Nsp11能抑制ERK信号通路,进而抑制TNF-a蛋白产生。运用反向遗传技术同时置换Nsp1β和Nsp11的PRRSV拯救毒能反转TNF-a蛋白差异表达的现象,证实Nsp1β和Nsp11在不同致病性PRRSV毒株诱导的TNF-α差异表达中发挥重要作用。研究结果表明,高致病性PRRSV通过其Nsp1β和Nsp11可有效抑制TNF-α产生,从而有利于其在宿主体内的复制,这可能是导致其致病性和毒力增强的机制之一。综上所述,我们的研究揭示了不同致病性PRRSV毒株对PAMs细胞因子表达的差异影响,并鉴定出Nsp1β和Nsp11是决定高、低致病性毒株诱导TNF-α差异表达的病毒蛋白。研究结果为阐明高致病性PRRSV毒株致病性增强的分子机制提供了科学依据。