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一、研究背景 幽门螺杆菌(H．pylori)感染为慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与肠型胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关。抗生素联合制酸剂为目前H．pylori感染主要的治疗方案，但随着细菌耐药、药物不良反应及药效经济学等问题的突出，研究接种简便、成本低廉并易于大面积推广的H．pylori口服疫苗越来越受到重视。 筛选高度保守，具有良好免疫原性和免疫反应性的表面抗原对H．pylori疫苗的研制具有重要的意义。尿素酶(Ure)既是定植因子，又是毒力因子，为H．pylori生存所必需。其B亚单位(UreB)抗原性最强，是目前较为肯定的H．pylori疫苗候选抗原。中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)为新近发现的H．pylori主要毒力因子。黏附素A(HpaA)为H．pylori鞭毛鞘膜蛋白，也是其主要的黏附因子。研究表明，三者序列高度保守，结合于菌体表面，具有较强的免疫原性，可作为有效的保护性抗原用于H．pylori感染的疫苗防治。 目前，国内外H．pylori口服疫苗的研究主要集中在蛋白质疫苗的研制。但蛋白质抗原的制备和纯化费时、费力，需同时应用佐剂才能诱导有效的免疫反应，而佐剂大多对机体有不同程度的毒性作用。探索新型疫苗系统对H．pylori口服疫苗的研制具有重要的实际意义。 DNA疫苗因可诱导全面的免疫应答、提供同种异株交叉保护作用、易于制备多价疫苗、兼有预防和治疗作用等特点在多种疾病的防治中显示出巨大的应用潜力。而与传统疫苗相比，活减毒鼠伤寒沙门菌这一新型口服疫苗载体释放系统亦具有无需纯化抗原，无需佐剂，可避免抗原在胃内的降解和变性等优点。大量试验证实，减毒伤寒沙门菌作为疫苗免疫载体接种人体是安全的，具有广阔的实际应用价值。 研究表明，单一的H．pylori保护性抗原组分免疫效果并不满意，多价疫苗将是今后H．pylori疫苗研究的方向。本研究旨在将H．pylori疫苗主要候选抗原UreB、NapA(HP-NAP亚基)及HpaA基因融合，并将其亚克隆入真核表达载博士学位论文体PIRES，然后导入活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，构建UreB一NapA一HpaA口服重组DNA疫苗，评价其免疫原性，为H. Pytori口服DNA疫苗的研制奠定基础。二、研究目的 l、构建ureB、n即A、hPaA原核表达系统，诱导表达并纯化相应蛋白UreB、N即A、HPaA，制备相应蛋白抗血清，评价其免疫原性; 2、构建并鉴定融合基因ureB一n叩刁一hPaA，将其导入真核表达载体PIRES，转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207，构建UreB一NapA一HpaA口服重组DNA疫苗。三、研究内容 第一部分 制备H.Pylori基因组DNA，以此为模板，引物ureBF:5’一GGAATTCTCGCAT GAA GTA GAA CAI，GA一3‘，ureBR:5‘一CCC AAG CTT Al，C CAC GAA CACAl，GGI人AG一3’;nop刁F:5’·GCGAATTCGCATTTGCAAGCGGATGCGATC·3’，nop月R:5’一GC AAG CTT AGC CAA ATG GGC TTG CAG CAT CC一3‘;hP喇F:5’一GC GAA TTC GAA AGG TAG TTT GGC AAT CGT-3‘，彻aAR:5‘一GCAAG CTT GCT TAA CTC TTT oGTA灯灯G CAeC一3’，PeR扩增ure刀，n叩月及彻酬基因片段，分别T-A克隆入载体pMD 18一T，转化受体菌XLI一Blue，筛选抗性克隆扩增，碱法抽提质粒，EcoRI及Hindm酶切回收目的片段，分别亚克隆入原核表达载体pET-22b，构建并鉴定重组质粒pET-22b一ureB，pET-22b-naP，4，PET-22b一hPaA。重组质粒分别转化表达受体菌BLZI一codonPlus⑧(DE3)，筛选抗性克隆，0.5 mmol/L IpTG诱导表达相应蛋白UreB、NapA、HpaA，SDS一队GE检测蛋白表达情况。将纯化蛋白腹部皮下注射免疫小鼠(1/w/2)，制备相应抗血清并Westem blot鉴定，EUSA测定抗血清效价。 第二部分 以H.刃lori基因组DNA为模板，引物ureBF:5几CGG CTC GAG ATG AAAAAG户a，TAGCAGAAAAG一3‘，ureBR:5‘一GCTAGCGAAAATGCTAAAGAGTTGC一3’;nop月F:5‘一GCT AGC Al，G AAAACATTTGAAAI，TCT-3‘，nop注R:5‘一ACT AGT AGC CAA Al，G GGC TTG CAG CA一3’:hPaAF:5‘一ACT AGT ATGAAAAAAGGTAGTTTGGC·3‘，hPaAR:5‘一ACGCGTCI人CTTTCGTTTTTTCAT TTC Ac一3‘，PcR扩增ureB，n叩A及hPaA基因全长序列(ureB、n叩月分一一一一一半 .5.博士学位论文别去除终止密码子以利融合蛋白表达)，分别T-A克隆入载体pMD 18一T，构建重组质粒pMD一ureB，pMD一n叩月，pMD一hPaA，鉴定插入方向并测序。 依次连接ureB，n即月及hPaA，构建并鉴定融合基因ureB一nc少月一hPaA，亚克隆入真核表达载体PIRES，构建重组质粒PIRES一ureB一n即刁一hPaA，酶切鉴定。 将重组质粒PIREs一ureB一n即A一hPaA转染COS一7细胞，Westem blot分析融合蛋白表达情况。 将PIRES一ureB一n即注一hPaA转化活减毒鼠伤寒沙门菌LBSO00进行甲基化修饰，筛选抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，进一步电击转化终宿主菌SL7207，PCR及双酶切鉴定。四、研究结果 第一部分 PCR自H刃lori基因组DNA中分别扩增出一约1 560 bp，408 bp，687 bp产物，与预计相符。重组质粒pET-22b一ureB经BamHI酶切后获得一约940bP片段;