论文部分内容阅读
抗生素一般由生长在土壤中的链霉菌产生,其生物合成所需的基因通常成簇位于染色体上并受到途径特异性调控基因的调控。这些调控基因位于次级代谢调控网络的最底层,只负责对相应抗生素基因簇中部分或全部基因的调控。最近从恰塔努加链霉菌L10中克隆出纳他霉素生物合成基因簇。通过体外凝胶阻滞电泳实验发现scnRⅡ直接结合在cnS2, senⅠ, scnJ, sncK, scnA, scnE, scnSl, sen.D这些基因的启动子上并成片激活纳他霉素生物合成簇上合成基因,后修饰基因以及潜在的转运基因的表达,这种结合能力受至ScnRⅡ蛋白N端PAS结构域的调节。对于scnRI缺失株的转录实验发现scnRII的转录受至ScnRI的正向调控。结合体外凝胶阻滞电泳以及Real-time PCR实验发现ScnRⅠ直接结合到scnRJ-scnRⅡ基因间隔区增强scnRⅡ的转录。序列比对发现ScnRⅠ结构域组成中含有AAA结构域的保守模体Walker A与Walker B,通过体外ATP酶活实验确定了ScnRⅠ蛋白具有ATP酶活的作用。为研究ATP酶活对于ScnRⅠ功能的作用,本文对Walker A模体进行定点突变后分别进行体外表达与体内回补,发现定点突变后的ScnRⅠ-SM几乎失去对scnI缺失株的回补作用,从而证明了AAA结构域的ATP酶活对ScnRⅠ行使功能至关重要。较为全面的揭示了ScnRⅠ的调控机制。通过纳他霉素生物合成基因簇的测序我们发现了一个胆固醇氧化酶的编码基因scnE采用PCR targeting的方法对其进行敲除,经发酵实验发现。scnE敲除株的纳他霉素产量下降约30%。由于胆固醇氧化酶在纳他霉素生物合成以及后修饰等环节中并不发挥作用,结合SignalP的N端信号肽预测。本文推测scnE表达后被转运到细胞外将其特定底物氧化为信号小分子从而调控纳他霉素的合成。本文通过对scnRⅠ与scnRⅠ的研究揭示了纳他霉素生物合成中双途径特异性调控基因的级联调控模式：ScnRⅠ通过结合在scnRⅡ,启动子上游序列增强scnRII的转录,从而增强纳他霉素合成基因簇上合成基因的表达,最终使纳他霉素大量合成,为揭示恰塔努加链霉菌高产机制提供理论基础。同时发现了一个潜在的纳他霉素合成的“调节基因”—scnE。