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目的本课题在CRISPR/Cas9技术的支持下,通过基因编辑Gp96序列,抑制其基因表达,研究Gp96在急性酒精性肝损伤过程中的作用及调控的分子机制。方法(一)设计质粒:NCBI中检索Gp96相关基因序列,在外显子中查找人鼠相同的Gp96基因序列,根据二者的蛋白保守功能域位置,将靶向突变的目标序列(CRISPR)设计在外显子4~9。将外显子4至外显子9进行序列比对,共发现6个相同的CRISPR序列位置,但经脱靶率分析后最终设计出3个CRISPR序列,并构建三种质粒。(二)有效sgRNA筛选及验证:将合成的三种质粒1:1:1混合转染小鼠成肌细胞C2C12,嘌呤酶素筛选转染成功的细胞,提取DNA进行PCR扩增、电泳、胶回收进行测序及有效sgRNA蛋白验证。(三)体外实验:培养小鼠成肌细胞C2C12,分为三组,Normal组:不做任何处理;Normal+alcohol组:直接给予酒精诱导培养;Gp96-sgRNA+alcohol组:将有效sgRNA进行稳定转染后给予酒精诱导培养。CCK-8细胞活性增殖检测;Hoechst33258细胞凋亡染色;免疫印迹检测相关因子表达:热休克蛋白Gp96,增殖细胞核抗原PCNA,细胞凋亡相关蛋白Caspase-3,应激蛋白HSP70,代谢关键酶细胞色素P4502E1(CYP2E1),磷酸化的信号转录因-3:p-STAT3。(四)体内实验:健康清洁昆明雄性小鼠36只,随机分为3组:Normal组(12只):小鼠正常饲养;saline+alcohol组(12只):尾静脉注射生理水(与有效sgRNA相同体积);Gp96-sgRNA+alcohol组(12只):尾静脉注射有效sgRNA。小鼠尾静脉注射后正常喂养3天,第三天末,56度红星二锅头(24mL/kg)经口一次性灌胃,禁食24h后统一处死。小鼠眼球取血,分离血清检测AST、ALT变化;石蜡切片苏木精-伊红染色(HE染色)检测小鼠肝脏损伤情况;过碘酸雪夫染色检测小鼠肝脏糖原变化情况;Hoechst 33258细胞凋亡染色检测肝细胞的凋亡情况;免疫印迹检测相关因子表达:热休克蛋白Gp96,增殖细胞核抗原PCNA,血管内皮生长因子VEGF,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3,应激蛋白HSP70、HSP27,代谢关键酶细胞色素P4502E1(CYP2E1),磷酸化的信号转录因-3:p-STAT3,肿瘤坏死因子TNF-α。结果DNA测序结果显示转染sgRNA1和sgRNA2细胞基因序列与正常序列相比无差别,转染sgRNA3细胞基因序列与正常序列相比,出现较大的差异,蛋白印迹验证结果显示转染sgRNA3的细胞Gp96蛋白表达量较正常细胞表达明显降低(P<0.01),差异具有显著统计学意义,确定sgRNA3为有效向导RNA。体外实验:1.CCK-8结果显示:与Normal组相比,Normal+alcohol组和Gp96-sgRNA3+alcohol组细胞生存率明显降低(P<0.05或P<0.01),其中有效质粒sgRNA3转染后细胞在酒精刺激后,生存率较正常细胞酒精刺激后降低更加明显(P<0.01);2.Hoechst 33528染色结果:与Normal组相比,Normal+alcohol组和Gp96-sgRNA3+alcohol组都发生了明显的细胞凋亡(P<0.01),Gp96-sgRNA3+alcohol组较Normal+alcohol组小鼠肝细胞凋亡更为显著(P<0.01);3.蛋白印迹结果:与Norma+alcohol组相比,Gp96-sgRNA3+alcohol组细胞CYP2E1,Caspase-3,HSP70的蛋白表达量显著增高(P<0.05或P<0.01),而Gp96,p-STAT3,PCNA的蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)。体内实验:1.血清转氨酶变化情况:saline+alcohol组和Gp96-sgRNA3+alcohol组小鼠血清中AST、ALT水平较Normal组明显升高(P<0.05或P<0.01),其中Gp96-sgRNA3+alcohol组小鼠血清中AST、ALT水平显著高于saline+alcohol组(P<0.01)。2.苏木精-伊红染色情况:与Normal组相比,saline+alcohol组和Gp96-sgRNA3+alcohol组小鼠均出现明显的肝损伤现象(P<0.01),其中Gp96-sgRNA3+alcohol组较saline+alcohol组小鼠肝细胞坏死分数升高更加明显(P<0.01)。3.过碘酸雪夫试剂染色结果:与Normal组相比,saline+alcohol组与Gp96-sgRNA3+alcohol组肝脏糖原明显减少(P<0.01),其中Gp96-sgRNA3+alcohol组较saline+alcohol组小鼠肝糖原含量减少更加显著(P<0.01)。4.Hoechst 33528染色结果:与Normal组相比,saline+alcohol组和Gp96-sgRNA3+alcohol组都发生了明显的细胞凋亡(P<0.01),Gp96-sgRNA3+alcohol组较saline+alcohol组小鼠肝细胞凋亡更为显著(P<0.05)。5.蛋白印迹结果:与saline+alcohol组小鼠相比较,Gp96-sgRNA3+alcohol组小鼠肝细胞内CYP2E1,Bax,Caspase-3,TNF-α的蛋白表达量显著增高(P<0.05或P<0.01),而Gp96,HSP27,HSP70,p-STAT3,PCNA,VEGF,Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论Gp96通过调节细胞增殖、凋亡和应激代谢等相关基因表达减轻了酒精诱导的急性肝损伤。利用CRISPR/Cas9技术靶向抑制小鼠Gp96基因的表达可以促进酒精诱导的小鼠急性肝损伤。