巨大芽孢杆菌L2中主要的物质基础及其生物活性的评价

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本文通过优化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)L2高产抗菌活性成分发酵培养基及最佳发酵条件,并对该菌物质成分进行了分离纯化、化学结构鉴定,对得到的LE4-5组分进行了抑菌活性测定及机制的初步探究,对分离鉴定的两个单体化合物进行了抑菌活性的筛选。所获得的结果如下:1、利用单因素试验、Plackett-Burman(PB)设计及响应面法分析对巨大芽孢杆菌L2的发酵培养条件进行优化,得到最优发酵条件为:葡萄糖添加量1.5%,蛋白胨添加量2.5%,牛肉膏4.58g/L,氯化钠3.23g/L,装液量50m L/250m L,接种量6%,初始p H为7,温度30℃,发酵时间48h,转速150 r/min,优化后发酵液抑菌圈直径为34.99(±0.14)mm,与方程预测值34.88mm接近,而原始发酵条件下的抑菌圈直径为14.55(±0.43)mm,说明优化后的发酵液抑菌活性比优化前提高了140.48%。2、利用GC-MS技术分析,推测LE4-3组分里的主要物质成分可能是苯乙酸乙酯、亚油酸乙酯、苯乙酸甲酯、硬脂酸乙酯等,LE4-5组分里主要物质成分可能是亚油酸、亚油酸甲酯、十五烷酸、油酸等。3、利用常压硅胶柱层析,凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析等技术对该菌株的次级代谢产物进行分离纯化,通过紫外光谱、ESI-MS、核磁共振等波谱解析技术对分离纯化得到的两个单体纯品进行分子量大小的判断和化学结构的鉴定,BM-3分子量为337,BM-4是棕榈酸(Palmitic acid)。以青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)Q11-2和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-37作为供试菌株,对BM-3、BM-4进行抑菌活性测定,结果表明BM-3对两株供试菌都具有抑菌活性,BM-4均无抑菌活性。4、以青枯雷尔氏菌Q11-2作为供试菌株,对LE4-5进行了抑菌活性实验及其对该菌株抑菌机理的初步探究,测定的电导率变化和核酸总蛋白外流的结果显示,LE4-5组分对青枯雷尔氏菌细胞膜通透性具有显著影响,且LE4-5组分能更快地产生效果,在足够长的时间尺度上,LE4-5对照会对细胞膜的通透性产生更大的伤害,造成更多的菌体内容物外流。OD260nm和OD280nm的检测结果可知LE4-5组分能对细胞产生影响,在起始时刻出现了核酸和蛋白的外流,分析为LE4-5组分对细胞膜通透性产生了作用,是否造成了细胞核的溶解还需要进一步研究。
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