纳米抗体是源自羊驼等动物特有重链抗体的一种单域抗体,具有稳定性强、溶解性好、亲和力高、免疫原性低以及生产成本低等特点,被广泛应用于生物医学研究领域。纳米抗体分子量仅为全长抗体的十分之一,导致其血液循环半衰期相对较短,是纳米抗体药物开发亟需解决的关键科学问题。目前相关研究主要采用包括聚乙二醇化、与Fc域融合、与人血清白蛋白融合、构建多价纳米抗体等策略延长纳米抗体的半衰期。然而,上述修饰策略仍然存在潜在的免疫原性挑战,尚不能有效改善纳米抗体的综合疗效。蛋白质的糖基化具有提高蛋白质水溶性,增强其生物活性以及延长半衰期的潜力。因此,本论文拟以靶向表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）的纳米抗体7D12为研究对象,通过对其进行定点6’-唾液酸乳糖修饰,探讨糖基化对纳米抗体半衰期及生物活性的影响。首先,通过原核表达制备了单价和二价的7D12纳米抗体。随后,通过分选酶A介导的连接反应（Sortase A-mediated ligation,SML）对7D12纳米抗体进行定点糖基化修饰,制备均一糖型的纳米抗体。然后,对糖基化纳米抗体的肿瘤细胞特异性、亲和力进行表征。最后,采用小鼠模型评估糖基化纳米抗体的药代动力学特征。主要研究结论如下:（1）发展了一种快速、高效的6’-唾液酸乳糖衍生物化学酶法制备策略。以乳糖为原料底物,经过10步化学酶法合成,最终6’-唾液酸乳糖衍生物2的总产率达到33%。（2）以本实验室前期构建的7D12纳米抗体为模板,利用Biobrick技术成功构建C端含有Myc和His融合标签的二价7D12纳米抗体表达载体,经E.coli BL21（DE3）发酵表达后,其终产量达到25.2 mg·L-1。（3）通过SML定点连接反应,制备C端含有6’-唾液酸乳糖修饰的单价、二价7D12纳米抗体。SDS-PAGE、Western Blotting以及蛋白质谱等表征证明了糖基化纳米抗体的正确性。（4）流式细胞术等表征表明,糖基化修饰纳米抗体未显著影响7D12纳米抗体对EGFR阳性肿瘤细胞的特异性识别。尽管两种糖基化修饰纳米抗体的亲和力有所降低,但是糖基化的二价7D12纳米抗体仍保留了较高的亲和力。（5）小鼠体内药代动力学评估表明,糖基化修饰可以提高7D12纳米抗体的血液循环半衰期,其中6’-唾液酸乳糖修饰的二价7D12纳米抗体半衰期达到了0.61 h,是未修饰二价7D12纳米抗体的1.2倍。