论文部分内容阅读
miRNAs (microRNAs)是真核生物体内由19-25个左右的核苷酸组成的、内源性的、非编码的单链小RNA分子,它们广泛分布于动物、植物、微生物、病毒中。miRNAs本身不具有开放阅读框(open reading frame, ORF),不编码蛋白质。研究证明,miRNAs控制着成千上万的基因的表达,与很多生物过程相关。在细胞的增殖、分化、衰老、凋亡以及细胞的新陈代谢、修复、组织识别等生物发生发育、生长控制过程,miRNAs都扮演着重要的角色,可通过检测miRNA的表达谱来预测肿瘤形成和类型。由于miRNAs被作为一种潜在的生物标志物,可用于多种人类疾病的预测、检测、诊断和治疗,因此建立一个操作简易、周期短、成本低、快速、准确的高通量的miRNAs检测平台具有重大而深远的科研意义。为了解决以上问题。本论文在新建立的一种新型的miRNAs芯片检测平台：“基于堆积杂交的通用标签检测方法”(Stacking-Hybridized Universal Tag assay, SHUT assay)。由于不同的碱基错配位点对SHUT assay平台的检测特异性影响大,为了更好区分miRNA序列的其他方式的碱基差异,实现在同一条件下进行多种miRNAs检测,实现高特异性的高通量检测,本文对SHUT assay平台的检测特异性进行了优化。本论文论文采用两步杂交法、一步杂交法和甲酰胺法,选用let-7家族的八个带有一个、两个、三个和四个碱基错配的具有高同源性的靶标miRNA对SHUT assay平台的检测特异性进行优化。1、两步杂交法改变杂交温度对SHUT assay平台的特异性优化有一定的效果。由优化结果可以看出SHUT assay平台对miRNA的检测特异性会随着第二步杂交温度的提高而提高。当第二步杂交温度提高到60℃,杂交1h,能够有效的降低非互补配对的靶标miRNA和探针的交叉杂交信号。除了个别含有A-G配对的难以区分的靶标和探针之外,总体的交叉杂交的假阳性信号在15%以下。但在此杂交条件下,低Tm值的靶标miRNA的如let-7f、let-7g和let-7i的正交信号较低。因此需要对该方法进行进一步的改进。2、为了提高两步杂交法中低Tm的正交的信号强度,本文在两步杂交方案进行了改进,通过降低第二步的杂交温度,延长杂交时间来降低交叉杂交的信号。由结果可以看出SHUT assay平台对miRNA的检测特异性会随着第二步杂交时间的延长而提高。当第二步杂交温度降低到48℃,杂交时间延长到9h时,低Tm值的靶标如let-7f、let-7g和let-7i与互补配对探针的正交信号都得到了提高,总体的交叉杂交的假阳性信号在20%左右。在该杂交提交下,芯片的杂交时间过长,延长了实验周期；同时非靶标与探针的交叉杂交信号需要进一步的降低,提高其检测特异性。3、为了进一步降低非靶标与探针的交叉杂交的信号,提高SHUT assay平台的检测特异性,同时缩短杂交时间,本文根据两步杂交法的优化结果,对SHUT assay平台的杂交方案进行了改进,将两步杂交法改进为一步杂交法,通过提高杂交温度对SHUT assay平台的检测特异性进行了优化。结果表明,一步杂交法中,SHUT assay平台的检测特异性随杂交温度的升高而得到了显著的提高。当杂交温度提高到48℃时,除了还有两对比较难以区分的靶标和探针的交叉杂交的信号还比较高之外,总体的交叉交叉杂交的假阳性信号降低到了10%,SHUT assay平台的特异性得到了明显的提高。4、甲酰胺法对SHUT assay平台的特异性进行了进一步的优化。由优化的结果表明,在杂交体系中添加10%甲酰胺,在54℃条件下连续杂交18h。在该条件下,let-7家族的八个靶标miRNA和探针的总体的都保持较为理想的正交的阳性信号,总体的交叉杂交的假阳性信号都控制在5%以下,let-7b和P-let-7c的交叉杂交的假阳性信号降低到15%,let-7c和P-let-7a的交叉杂交的假阳性信号也降低到47%,这两对非互补配对的靶标和探针的交叉杂交的假阳性信号百分比比国际上miRNA芯片技术信誉较好的Agilent公司的结果还低,并且总体的假阳性信号也优于Agilent公司的let-7家族的八个靶标miRNA的正交结果。评价其检测灵敏度,最低检测浓度可以达20fM,并且在20fM至200pM的浓度之间具有较好的线性关系。通过本文的优化SHUT assay平台实现了在同一条件下进行多种miRNA的检测具有高的特异性,同时也具有较好的检测灵敏对,为该平台接下来的优化工作提供了极好的条件。在未来的工作中,还存在有待解决的问题。首先,SHUT assay平台对于位于远离堆积处的单碱基错配的检测特异性有待提高,如let-7b与P-let-7c、let-7c与P-let-7a等,由于碱基错配位于远离堆积处的一端,交叉杂交信号难以控制。如果单纯通过提高温度降低交叉杂交信号,一方面影响低Tm值的靶标的检测信号,另一方面也会影响芯片的检测灵敏度。可以通过探针的Tm值均一化解决这个问题。其次,SHUT assay平台不易于分辨在带有A-G单碱基错配的高同源性序列,如let-7a与P-let-7c、let-7e与P-let-7a等在检测中的交叉杂交的假阳性信号比较高,A-G的碱基错配容易导致存交叉杂交的假阳性信号,需要解决DNA\RNA杂交体的杂交动力学的难题。