细胞增殖与凋亡是细胞生命活动的一个关键事件,受到多种因素精确严密的调控。然而,在某些情况下,细胞增殖和凋亡出现异常,诱发肿瘤的形成。抑癌基因和原癌基因在细胞增殖与凋亡中起着至关重要的作用,两者相互联系又彼此制约,当其中任何一环节出现问题,将有可能导致细胞癌变,形成肿瘤。其中p53是一种关键的抑癌基因,野生型p53基因在DNA损伤修复,阻止细胞转化,从而防止肿瘤形成等方面发挥着重要作用。大约50%的肿瘤中发生了p53的突变。在一些恶性肿瘤中,由于其他因素的作用,改变了p53的正常功能而导致了肿瘤的发生。目前研究较多的是癌基因hdm2。Hdm2蛋白能够直接结合于p53蛋白的酸性活化结构域和部分转录激活结构域,形成p53-hdm2复合物,可以抑制p53介导的转录激活功能。因此,p53-hdm2相互作用成为抗癌药物重要的药靶,以此为药靶进行药物发现和药物筛选,抑制hdm2与p53的相互作用,对于激活肿瘤细胞中p53信号通路,对抑制肿瘤的生长具有非比寻常的意义。生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)技术是近10年来出现的一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的新技术。BRET技术是基于萤光素酶与底物作用产生的萤光与邻近的荧光基团之间的能量共振现象并导致能量供体(萤光素酶)和能量受体(荧光蛋白)之间的能量转移而设计的。将两种目的蛋白分别与荧光素酶基因和荧光蛋白基因融合,若两种目的蛋白存在相互作用,荧光素酶与荧光蛋白之间会发生共振能量转移,荧光素酶发出的光会被荧光蛋白吸收并进而激发出荧光,因此可以通过检测荧光蛋白荧光强度的强弱来反应目的蛋白相互作用与否或者相互作用程度。这种方法是检测蛋白-蛋白之间相互作用的重要技术。它的最大优势是能在活细胞中进行实时检测,因此能够进行相互作用动力学的研究。我们首先采用MTT法,我们对我校的上海分子治疗和新药创制工程技术研究中心胡文浩老师课题组合成的近100种化合物在HCT116细胞上初步筛选。为了进一步确定这些化合物的抑制癌细胞生长的活性是否与抑制p53与hdm2的相互作用有关,我们对有活性的小分子化合物采用p53敲除的HCT116细胞进行了第二次筛选。根据结果初步判断S-1s、S-1t、S-1u、S-1v、S-1w和S-1x在生物活性和p53选择性上具有比较理想结果。第二步,BRET模型的构建。首先克隆hdm2和p53基因,并将hdm2和p53基因分别与荧光素酶基因Rluc和荧光蛋白基因eGFP融合,形成融合蛋白,按照一定比例共转HEK393T细胞,加入荧光素酶底物后,检测荧光蛋白的荧光强度,以此来判断两种目的蛋白的相互作用情况及药物对其相互作用的干扰能力。我们用临床Ⅱ期的阳性化合物Inutlin3来验证我们构建的BRETT型,该化合物能特异性的抑制p53与hdm2的相互作用,结果显示笔者构建的BRET模型能够用于p53与hdm2相互作用小分子抑制剂的筛选。第三步,为了进一步分析这些化合物对p53-hdm2相互作用的抑制作用,我们对在第一章中的介绍的MTT结果加以分析,挑选出一些化合物,用这个BRET模型,进一步研究了这些化合物对p53与hdm2相互作用的抑制效果。结果显示,S-1s和S-1t对于p53-hdm2的相互作用表现出不错抑制作用,可作为先导化合物进一步优化。