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人牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells,HGECs)长期暴露于大量的细菌环境中,是防御病原微生物入侵牙周组织的第一道屏障。牙周炎是一种慢性感染性疾病,长期的细菌内毒素(lipopolysaccharide,LPS)刺激可能会诱使HGECs对后续刺激的反应性降低,即产生内毒素耐受。内毒素耐受的机制究竟是什么,是否与LPS的信号识别受体Toll样受体 2(toll-like receptor 2,TLR2)和 Toll 样受体 4(toll-like receptor 4,TLR4)有关,它将如何影响牙周炎症的发生和发展,目前尚不得而知。目的:本研究旨在建立一种HGECs的内毒素耐受模型,并初步探讨内毒素耐受在牙周组织炎症反应中的作用和机制,为进一步阐明牙周炎发生发展的免疫学机理提供实验数据。方法:1.利用酶消化法体外分离培养HGECs;检测角蛋白和波形丝蛋白的表达,以确定其生物学来源;并采用MTT法观察HGECs在体外的生长特性。2.采用 1μg/ml 牙銀卟啉单胞菌(Pophyromonasg gingivalis,P.gingivalis)LPS和/或1μg/ml大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)LPS重复刺激或交叉重复刺激,建立HGECs的内毒素耐受模型。利用ELISA法检测炎症因子IL-1β、IL-6,和趋化因子IL-8表达水平的变化。3.采用逆转录PCR技术检测TLR2,4 mRNA在HGECs的表达;采用real-time PCR技术和流式细胞术检测HGECs产生内毒素耐受或交叉耐受后,TLR2,4 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:1.通过酶消化法分离培养的HGECs表达角蛋白,属于外胚层来源的细胞,在体外具有良好的增殖能力。2.1 μg/ml P.gingivalis LPS 或 1μg/ml E.coli LPS 刺激 HGECs 24h 后,细胞条件培养液中均可检测到IL-1β、IL-6和IL-8,三种细胞因子的分泌水平均较刺激前明显增高(p<0.05)。上述两种LPS重复刺激或交叉重复刺激后,IL-6和IL-8的表达水平均较单次刺激后明显降低(p<0.05);1μg/ml E.coli LPS重复刺激后,IL-1β的分泌水平也较单次刺激后明显降低(p<0.05)。表明,内毒素耐受模型的构建是成功的。3.来自不同个体的HGECs 均表达TLR2,4mRNA。1μg/ml P.gingivalis LPS刺激HGECs后,TLR2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调(p<0.05);1μg/ml E.coli LPS刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表达水平也明显上调(p<0.05)。1μg/ml P.gingivalisLPS重复刺激后,TLR2 mRNA和蛋白表达水平较单次刺激后明显降低(p<0.05);1μg/ml E.coli LPS重复刺激后,TLR4 mRNA和蛋白表达水平也较单次刺激后明显降低(p<0.05)。结论:本研究首次构建了 HGECs的内毒素耐受模型,并初步探讨了内毒素耐受对牙周组织炎症和免疫反应的影响,及其作用机制。研究结果显示,P.gingivalis LPS和(或)E.coli LPS重复刺激能诱导HGECs产生内毒素耐受,不同程度的抑制细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的分泌,这种耐受可能与TLR2,4表达水平的降低有关。