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研究目的原发性肝癌是世界范围内的第二大致死肿瘤,肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）约占其中的90%。HCC是一种病情复杂的高异质性肿瘤,临床症状和分期相似的病人对药物的治疗反应度大相径庭。近年来随着靶向药和免疫疗法的涌出,多种肿瘤的治疗效果得到提升,但是肝癌的治疗有效率远低于其他肿瘤。同时,由于肝癌的早期隐匿性强、诊断难度大等原因,大多数患者确诊时即为晚期,失去了手术等可能实现长期生存的治疗机会。因此探索肝癌治疗的有效方案,是科研工作者和临床医师亟需解决的关键问题。对于肝癌这种异质性高,并且对多种疗法普遍抵抗的肿瘤来说,联合治疗是实现疗效最大化的必要措施。基于合成致死效应的联合治疗策略,是指同时靶向两种不同的分子导致细胞死亡的方式,在肿瘤治疗中获得了很好的效果。在肝癌进展的过程中,慢性炎症环境与持续的复制压力能够导致细胞的大量DNA损伤,进而使感知DNA损伤的关键分子聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（poly[ADP-ribose]polymerase 1,PARP1）持续活化。新近研究显示,很多对免疫检查点抑制剂不敏感的肿瘤,能够在靶向PARP1的合成致死治疗方案中达到较好的治疗效果。研究证实PARP1在肝癌进展中具有关键的作用,但目前靶向PARP1的肝癌临床试验效果并不尽人意,因此探索能够与PARP1发生协同治疗效应的合成致死靶点至关重要。研究方法通过临床组织样本收集、实验检测和数据库分析,结果提示在HCC中PARP1和Src联合具有合成致死的潜力。进一步通过细胞增殖、克隆形成和迁移能力等HCC细胞的恶性表型检测,以及斑马鱼和小鼠肝癌的荷瘤动物模型证实,联合靶向PARP1和Src在肝癌中有合成致死效应。在HCC细胞模型中,通过Western Blot,免疫荧光,流式细胞术和体外激酶实验等探究联合治疗的分子机制;并利用CRISPR/Cas9技术构建PARP1敲除的HCC细胞系,通过回补实验深入阐明联合靶向PARP1和Src诱导合成致死效应的分子机理。研究结果1.PARP1和Src是具有治疗潜力的诱导肝癌合成致死效应的组合收集临床肝癌患者组织样本进行检测,并对TCGA数据库进行分析,结果显示PARP1的高水平表达与肝癌患者的不良预后显著正相关,这为靶向PARP1在肝癌治疗中的可行性提供了依据。基于CTRP数据库进行蛋白与抑制剂耐药的相关性分析显示,非受体酪氨酸激酶Src可能是在HCC治疗中与PARP1具有协同效应的分子;进一步通过CRISPR/Cas9技术构建PARP1-/-Huh7细胞验证靶向Src和PARP1的协同效应。2.肝癌细胞恶性行为检测表明联合靶向PARP1和Src具有合成致死效应。对HCC细胞给予浓度梯度的PARP1或Src抑制剂进行单独或联合处理,通过CCK-8实验测定细胞活性并计算抑制剂的联合指数（combination index,CI）,结果显示联合靶向PARP1和Src具有合成致死效应（CI＜1）。细胞增殖、克隆形成和细胞迁移实验结果显示,这种联合靶向策略能够显著抑制HCC细胞的恶性表型。3.HCC荷瘤动物实验验证了联合靶向PARP1和Src对于肝癌的合成致死效应。构建斑马鱼和小鼠的肝癌荷瘤模型,并给予PARP1和Src抑制剂的联合治疗。结果显示,与单独给药组相比,联合靶向策略能够诱导协同效应,显著抑制肿瘤的生长,且对小鼠没有明显的肝肾毒性和其他毒副作用。4.联合靶向PARP1和Src通过抑制mTORC1信号通路实现合成致死效应Western Blot实验结果显示,联合靶向PARP1和Src能够显著抑制HCC细胞的mTORC1等增殖相关的信号通路。同时,PARP1和Src抑制剂分别使HCC细胞阻滞于G2/M和G1/S期,而联合治疗则会对细胞周期阻滞产生多效效应,进而使细胞产生大量DNA损伤积累,并最终诱导细胞凋亡。5.PARP1和Src能够在HCC细胞中相互作用。为了深入阐明PARP1和Src作为合成致死组合的分子机制,我们对临床肝癌组织样本进行Western Blot和免疫组化检测,结果显示PARP1的表达水平与Src的活化水平显著正相关。数据库分析结果显示,PARP1和Src的过度活化参与肝癌的进展,且与患者的生存期显著负相关,提示二者在肝癌进展中的相互调控效应。免疫共沉淀和激光共聚焦实验结果显示,PARP1和Src能够在HCC细胞中结合和共定位,而Src的激酶结构域和PARP1的DNA结合结构域是二者结合的分子基础。6.Src对于PARP1-Y992位点的磷酸化修饰导致HCC细胞对PARP1抑制剂耐药。免疫共沉淀和体外激酶实验结果显示,Src能够对PARP1进行酪氨酸磷酸化修饰,进一步分析其作用位点,显示PARP1的992位酪氨酸位点（Y992）是Src的修饰位点。将PARP1-Y992突变体回补至PARP1-/-Huh7细胞中,结果显示PARP1-Y992位点的磷酸化能够诱导HCC对PARP1抑制剂的耐药性,进而为联合靶向PARP1和Src实现合成致死效应提供分子基础。研究结论与创新性1.联合靶向Src和PARP1是能够在肝癌中实现合成致死效应的新型靶点组合。2.Src介导的PARP1-Y992位点的酪氨酸磷酸化修饰能够诱导HCC对PARP1抑制剂的治疗抵抗,提示PARP1-Y992位点的磷酸化状态有成为肝癌临床新型标记物的潜力,为肝癌患者的治疗选择提供了新的分子分型策略。3.联合靶向PARP1和Src的治疗方案能够通过影响HCC细胞中的mTORC1信号通路和周期检查点蛋白来诱导细胞周期阻滞,使DNA损伤积累而进一步诱导细胞凋亡,发挥合成致死效应。