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目的基于肿瘤干细胞的耐药特性联合单细胞克隆培养观察并检测人舌癌阿霉素耐药细胞系的克隆生物学特性,以期进一步富集到含高比例的舌癌干细胞特征样细胞。方法第一部分实验:以前期实验建立的人舌癌阿霉素耐药细胞Tca-8113/ADM-P4作为研究对象。将Tca-8113/ADM-P4细胞和经浓度为0.01μg/ml、0.05μg/ml的阿霉素对Tca-8113/ADM-P4体外干预48h获得的耐药存活细胞(分别命名为O.O1μg/mlDSC、0.05μg/mlDSC),分别进行单细胞克隆培养2周,从克隆形成率、各类克隆构成比以及克隆增殖能力来观察克隆形成情况。第二部分实验:将Tca-8113/ADM-P4、0.01μg/mlDSC、0.05μg/mlDSC形成的全克隆和部分克隆细胞进行体外连续扩增培养,然后利用实时荧光定量PCR及免疫缺陷裸鼠成瘤实验来检测全克隆和部分克隆细胞的特性。结果第一部分实验:(1 )Tca-8113/ADM-P4、0.01μg/mlDSC、0.05μg/mlDSC细胞经单细胞克隆培养均能形成全克隆、部分克隆与旁克隆。Tca-8113/ADM-P4的克隆形成率为70.75%,形成的全克隆、部分克隆和旁克隆构成比分别为29.05%、48.60%和22.35%。0.01μg/mlDSC的克隆形成率为58.27%,形成的全克隆、部分克隆和旁克隆构成比分别为19.75%、27.16%和53.09%。0.05μg/mlDSC的克隆形成率为54.86%,形成的全克隆、部分克隆和旁克隆构成比分别为13.92%、31.65%和54.43%。 (2)Tca-8113/ADM-P4、0.01μg/mlDSC 和 0.05μg/mlDSC 的克隆生长曲线显示:全克隆的增殖速度最快,旁克隆的增殖速度最慢,部分克隆的增殖速度介于两者之间。第二部分实验:(1) Tca-8113/ADM-P4、0.01μg/mlDSC、0.05μg/mlDSC形成的全克隆和部分克隆均能体外连续扩增培养。(2)实时荧光定量PCR检测结果显示:ABCG2、CXCR4在0.05μg/mlDSC全克隆和部分克隆细胞的表达高于Tca-8113/ADM-P4及0.01μg/mlDSC的全克隆和部分克隆,差异有统计学意义(P<0.05)。(3) Tca-8113/ADM-P4、0.01μg/mlDSC和0.05μg/mlDSC的全克隆细胞均能在裸鼠皮下成瘤,成瘤率为100%,0.05μg/mlDSC的全克隆细胞成瘤时间比Tca-8113/ADM-P4的全克隆细胞成瘤时间短,且差异有统计学意义(P<0.01) ; Tca-8113/ADM-P4、0.01μg/mlDSC和0.05μg/mlDSC的部分克隆细胞接种裸鼠皮下均成瘤,成瘤率分别为100%、97.22%、94.44%,0.05μg/mlDSC的部分克隆成瘤时间比Tca-8113/ADM-P4的部分克隆成瘤时间短,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)舌癌阿霉素耐药细胞Tca-8113/ADM-P4、O.O11μg/mlDSC、0.05μg/mlDSC分别通过单细胞克隆培养均可形成全克隆、部分克隆、旁克隆。(2)Tca-8113/ADM-P4部分克隆细胞能体外连续扩增培养,可能含有肿瘤干细胞特征样细胞,具有自我更新能力、不断增殖潜能和致瘤性。(3)舌癌耐药细胞Tca-8113/ADM-P4经体外阿霉素干预联合单细胞克隆培养,可以进一步富集到舌癌肿瘤干细胞特征样细胞。