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背景和目的:巨噬细胞在固有免疫和特异性免疫反应中起着显著作用。在非特异性免疫中,当炎症刺激或组织损伤时,巨噬细胞能吞噬和清除胞外物质、凋亡细胞和碎片;在特异性免疫中,巨噬细胞具有递呈抗原并分泌各种细胞因子、生长因子和趋化因子,刺激活化T淋巴细胞,参与调节免疫反应。MicroRNA广泛存在于真核生物中,能通过碱基互补配对的方式靶向结合靶基因miRNA序列的3’UTR,降解靶基因miRNA或抑制基因miRNA的翻译,从而负调节转录后水平基因的表达。本课题组前期已通过体外实验证明miR-16与小鼠腹腔巨噬细胞分化有关。为了进一步从体内研究miR-16与巨噬细胞分化的关系,本课题组从美国Jackson实验室引进了 miR-15a/16-1基因敲除小鼠。本研究拟探讨miR-15a/16-1的缺失在肝癌和肠炎小鼠模型中对巨噬细胞表型和功能的影响及其分子机制研究,为以巨噬细胞为靶标的免疫治疗策略的制定提供新的思路。方法:1.不同状态下miR-15a/116-1-/-（KO）小鼠体内巨噬细胞亚群的检测1.1研究生理状态下小鼠脾脏中巨噬细胞频率及表型分别取生理状态下的miR-15a/16-1+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）C57雌性小鼠的眼外周血,采用ELISA法检测血清中IL-10和IL-12水平;然后将其脱颈处死,取出脾脏研磨,制成单细胞悬液,通过流式细胞术检测其脾脏中F4/80+、F4/80+CD16/32+、F4/80+CD206+细胞的频率和表型。1.2研究荷瘤状态下小鼠体内巨噬细胞频率及表型鼠肝癌细胞系H22细胞培养于含10%胎牛血清的RIPA1640培养基中,培养条件为37℃、5%CO2。取处于对数分裂期的H22细胞,等量、同角度、同部位分别皮下注入miR-15a/16-1+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）C57雌性小鼠左侧腋窝下,成瘤第7天到第15天后荷瘤结束,观察两组小鼠肿瘤生长情况和生存情况,期间每天同一时间测量两组小鼠的肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线。荷瘤第15天,脱颈处死小鼠,肉眼观察两组小鼠剥离的肿瘤大小和形态。取两组荷瘤小鼠部分肿瘤（经10%甲醛固定）制成石蜡切片后HE染色,观察肿瘤的组织形态,将剩余部分肿瘤和脾脏消化制成单细胞悬液,流式细胞术分别检测两组小鼠脾脏和肿瘤中F4/80+,F4/80+CD 16/32+,F4/80+CD206+细胞频率及表型。1.3研究肠炎状态下小鼠体内巨噬细胞频率及表型取miR-15a/16-1+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）C57雌性小鼠,分别喂养2%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液,每天称其体重并绘制小鼠体重曲线;一周后,见鼠笼中有明显便血现象,将小鼠脱颈处死,取出其脾脏和部分肠道组织,脾脏制成单细胞悬液,用流式细胞术分别检测其脾脏中F4/80+、F4/80+CD16/32+和F4/80+CD206+细胞频率和表型;肠道组织（经10%的福尔马林固定）制成病理石蜡切片后用免疫组化检测肠道组织中CD68+、CD86+、CD206+阳性率的表达。2.miR-15a/16-1对小鼠巨噬细胞分化机制的研究2.1研究荷瘤状态下,小鼠体内血清中M-CSF的水平和巨噬细胞M-CSF-R的表达对miR-15a/16-1+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）C57雌性荷瘤15天的小鼠进行眼眶取血,离心后取上清,用ELISA法检测小鼠外周血上清中M-CSF的水平,另外,将小鼠脱颈处死,取其脾脏研磨制成单细胞悬液,用流式细胞术检测其脾脏中F4/80+CD115+细胞的表达。2.2研究荷瘤和肠炎状态下,小鼠体内巨噬细胞PD-L1的表达取miR-15a/16-1+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）C57雌性荷瘤小鼠,荷瘤15天后,脱颈处死取其脾脏和肿瘤制成单细胞悬液,用流式细胞术分别检测其脾脏和肿瘤中PD-L1+的表达;将上述两组小鼠分别喂养2%DSS溶液,一周后,见鼠笼中有明显的便血现象,将小鼠脱颈处死,取出其脾脏和部分肠道组织,脾脏制成单细胞悬液,用流式细胞术检测其脾脏中PD-L1+的表达。2.3研究生理状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏中巨噬细胞STAT3,SOCS3,NF-κB信号分子的表达水平分别将生理状态下的miR-15a/16-1+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）C57雌性小鼠脱颈处死,取出其脾脏,用磁珠分选法分选出巨噬细胞,利用westernblot检测巨噬细胞中STAT3、SOCS3、NF-κB信号分子的表达。结果:1.miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠巨噬细胞频率、表型和功能的变化1.1生理状态下,miR-15a/16-]+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠中巨噬细胞频率和表型无明显变化流式细胞术检测结果表明,在生理状态下,与miR-1 5a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏中 F4/80+,F4/80+CD16/32+,F4/80+CD206+细胞的频率无明显变化,此结果说明,两组小鼠中巨噬细胞,M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞频率无明显的变化。1.2荷瘤状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠中巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞频率均稍减少肿瘤生长曲线结果表明,与miR-15a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠肿瘤生长缓慢,体积变小;流式细胞术检测结果表明,H22肝癌细胞荷瘤状态下,与 miR-15a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏和肿瘤中 F4/80+、F4/80+CD16/32+和F4/80+CD206+细胞的频率均稍减少;上述结果说明,荷瘤状态下,小鼠miR-15a/16-1基因的缺失导致小鼠体内巨噬细胞、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞频率稍减少,使小鼠处于肿瘤抑制状态。1.3肠炎状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠中巨噬细胞频率增多,M1型巨噬细胞频率增多,M2型巨噬细胞频率无明显变化与miR-15a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠体重明显下降;流式细胞术检测结果表明,DSS肠炎状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏中F4/80+细胞的频率增多,F4/80+CD16/32+细胞的频率增多,F4/80+CD206+细胞的频率无明显变化;免疫组化结果表明,与miR-15a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠肠道CD68+表达量增多,CD86+细胞的表达量增多,CD206+表达量无明显变化;上述结果说明,DSS肠炎状态下,小鼠miR-15a/16-1基因的缺失导致小鼠体内巨噬细胞频率增多,M1型巨噬细胞频率增多,M2型巨噬细胞频率无明显变化,使小鼠处于促炎状态。2.miR-15a/1 6-1-/-（KO）小鼠巨噬细胞分化机制的结果2.1荷瘤状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠体内血清中M-CSF的水平和巨噬细胞M-CSF-R的表达无明显的变化ELISA结果表明,miR-15a/16-1+/+（WT）和miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠外周血血清中M-CSF的水平无明显的变化;流式细胞术检测结果表明,两组小鼠脾脏中F4/80+M-CSF-R+表达无明显变化;结果说明,miR-15a/16-1基因不对小鼠血清中M-CSF水平产生影响。2.2荷瘤和肠炎状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠体内巨噬细胞PD-L1表达无明显变化流式细胞术检测结果表明,H22肝癌细胞荷瘤状态下,与miR-15a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏和肿瘤中F4/80+PD-L1+细胞的频率无明显变化,DSS肠炎状态下,与 miR-15a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏中 F4/80+PD-L1+细胞的频率无明显变化;此结果说明,在荷瘤和炎症小鼠体内miR-15a/16-1可能不直接调控PD-L1。2.3生理状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏巨噬细胞中STAT3表达水平升高,SOCS3表达水平下降,NF-κB表达水平无明显变化Westernblot检测结果表明,在生理状态下,与miR-15a/16-1+/+（WT）小鼠相比,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠脾脏中STAT3信号分子蛋白表达量升高,SOCS3信号分子蛋白表达量下降,NF-κB表达水平无明显变化;结果说明,miR-15a/16-1可能负调控STAT3信号分子的表达。结论:1.生理状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠中巨噬细胞、M1和M2型巨噬细胞频率和功能无明显变化;2.H22肝癌细胞荷瘤状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠中巨噬细胞频率减少、M1型巨噬细胞频率减少和M2型巨噬细胞频率减少,M1/M2的比例增多,小鼠处于肿瘤抑制状态;3.DSS肠炎状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠中巨噬细胞频率增多、M1型巨噬细胞频率增多和M2型巨噬细胞频率无明显变化,M1/M2的比例增多,小鼠处于促炎状态。4.H22肝癌细胞荷瘤状态下,miR-15a/16-/-（KO）小鼠体内血清中M-CSF的水平,巨噬细胞M-CSF-R的表达和PD-L1的表达无明显变化;DSS肠炎状态下,miR-15a/16-1-/-（KO）小鼠体内巨噬细胞PD-L1的表达无明显变化。5.生理状态下,miR-15a/16-1的功能可能与STAT3信号分子有关。