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【研究背景与目的】动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是一种以脂质在动脉血管壁沉积为特征的多因素疾病,巨噬细胞源性泡沫细胞形成在As病理进程中起到关键作用。组织酸化(Acidosis,p H?7.0)是As的另一重要病理特征,且其酸化程度与巨噬细胞的泡沫化正相关。酸敏感离子通道1(Acid-sensing ion channel 1,ASIC1)是由细胞外H+激活的阳离子通道。ASIC1表达于巨噬细胞,其激活可促进巨噬细胞诱导的炎症应答,但ASIC1在巨噬细胞内脂质蓄积中的作用及其机制尚待阐明。鉴于As病理进程中发生组织酸化,而胞外酸化促使巨噬细胞ASIC1异常激活。因而,阐明胞外酸化微环境在巨噬细胞源性泡沫形成中的作用及其机制,将成为As性心血管疾病防治领域中一个新的、值得关注的课题。在本研究中,我们旨在探讨胞外酸化是否是通过ASIC1抑制ABCA1途径依赖的胆固醇流出,从而促进巨噬细胞的脂质蓄积。【方法】本课题拟在p H 6.5的酸性微环境,构建RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型,以模拟As病理条件下微环境酸化和巨噬细胞内的脂质蓄积。首先用油红O染色检测细胞内的脂质蓄积,明确胞外酸化促进巨噬细胞脂质蓄积;蛋白质印迹法(Western blotting,WB)法检测ASIC1、calpain1、ABCA1等蛋白的表达;胆固醇荧光试剂盒检测ABCA1介导的胆固醇流出,以阐明巨噬细胞ASIC1激活上调calpain1,抑制ABCA1的表达及其介导的胆固醇流出。然后用Amiloride(ASICs非选择性抑制剂)干预胞外酸化巨噬细胞,油红O染色检测细胞内的脂质蓄积,WB法检测ASIC1、calpain1、ABCA1等蛋白的表达,胆固醇荧光试剂盒检测ABCA1介导的胆固醇流出,明确抑制ASIC1可逆转胞外酸化促巨噬细胞脂质蓄积作用;最后分别以Pc Tx-1(ASIC1特异性抑制剂)、PD150606(calpain1抑制剂)、干预胞外酸化巨噬细胞,油红O染色检测细胞内的脂质蓄积,WB法检测calpain1和ABCA1等蛋白的表达,胆固醇荧光试剂盒检测ABCA1介导的胆固醇流出,RT-q PCR检测ABCA1 m RNA的表达,以揭示胞外酸化是通过激活ASIC1上调calpain1蛋白的表达,进而促使巨噬细胞ABCA1蛋白的降解以减少细胞内ABCA1依赖的胆固醇流出,从而促进巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。【结果】1.与正常对照组相比较,酸性微环境处理组(简称酸处理组)巨噬细胞内脂质蓄积显著增加,ASIC1、Calpain1蛋白含量显著升高,ABCA1的蛋白水平以及其介导的胆固醇流出显著减少。2.与酸处理组相比较,低浓度和高浓度Amiloride干预组巨噬细胞内的脂质蓄积显著减少,ASIC1、Calpain1蛋白含量显著降低,ABCA1的蛋白表达以及其介导的胆固醇流出显著增加。3.与酸处理组相比较,Pc Tx-1和PD150606干预组的巨噬细胞脂质蓄积显著减少,ASIC1、Calpain1蛋白含量显著降低,ABCA1的蛋白表达以及其介导的胆固醇流出显著增加;PD150606干预组ABCA1 m RNA的表达无显著变化。【结论】1.ASIC1是胞外酸化促巨噬细胞泡沫化的关键受体;2.ASIC1调控calpain1/ABCA1依赖的胆固醇流出是胞外酸化促巨噬细胞脂质蓄积的重要机制。