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目的:卵巢癌是女性生殖系统死亡率最高的肿瘤。卵巢浆液性癌占卵巢原发恶性肿瘤的30-40%。由于缺少早期筛查手段和明显的临床症状,多数患者确诊时已是晚期,且伴有扩散和转移。扩散转移和异质性作为肿瘤恶性生物学行为的主要特征,是导致患者预后不良的主要原因。肿瘤的扩散转移表现为肿瘤细胞迁移和侵袭能力增强,细胞增殖速率加快,倍增时间缩短等。肿瘤的异质性表现为细胞形态学、表面标志物、细胞增殖能力、迁移侵袭能力和化疗耐药性等的差异。化疗耐药是导致卵巢癌患者预后不良的主要原因之一。紫杉醇作为卵巢癌化疗的一线药物,其治疗效果被广泛认可。目前研究证实紫杉醇通过促进微管蛋白的组装并抑制其解聚进而引起细胞周期停滞、凋亡和耐药性的发生。因此,从分子水平明确逆转卵巢癌恶性生物学行为和紫杉醇耐药的调控机制,对开发新的靶向药物以改善患者的预后具有重要的科学意义。长链非编码RNA(lnc RNAs)的异常表达可影响肿瘤的恶性生物学行为和耐药的发生。大量研究证据表明,lnc RNA-小核仁RNA宿主基因16(small nucleolar RNA host gene 16,SNHG16)可竞争性结合多种mi RNA调控其靶基因的表达促进多种肿瘤发生和转移。在卵巢癌中,一项研究数据表明SNHG16可促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。但SNHG16与卵巢癌紫杉醇耐药之间尚无研究。课题组前期研究发现SNHG16的转录本SNHG16-L和SNHG16-S在卵巢癌紫杉醇敏感及耐药细胞中存在表达差异,但二者是否存在功能差异未见报道。为探索SNHG16-L/S在卵巢癌中是否存在功能差异及可能的作用机制,我们通过生物信息学网站预测发现SNHG16可能通过CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding proteins,CEBPB)调节反式作用T细胞特异性转录因子(Trans acting T cell specific transcription factor,GATA3)转录活性。CEBPB作为转录因子CEBP家族的重要成员之一。在卵巢癌中,CEBPB可增强H3K79甲基转移酶DOT1L的活性,促进卵巢癌顺铂耐药的发生。Guo等发现lnc RNA GAS5可与CEBPB结合,阻断CEBPB对GDF15的转录调节作用,抑制卵巢癌的发生。GATA3是锌指DNA结合蛋白GATA家族的重要成员之一。大量研究表明GATA3可作为卵巢癌的独立危险因素,可显著促进卵巢癌恶性生物学行为,并参与紫杉醇耐药的调节。然而,在卵巢癌中尚无关于SNHG16、CEBPB和GATA3三者之间的机制研究。SNHG16-L/S的功能差异提示其可能受可变剪切调控。可变剪切是指同一种pre-m RNA通过不同的剪切形式产生不同的剪切异构体。近年来研究发现RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBPs)作为一类可与RNA结合的蛋白,也可以调控lnc RNAs的可变剪切介导肿瘤的发生。2017年,Yuan等人首次发现MBNL3可诱导lnc RNA PXN-AS1外显子4的包含使其转录本出现功能差异促进肝细胞癌的发生。我们前期通过生物信息学预测发现SNHG16-L可能与前体RNA加工因子6(pre-m RNA processing factor,PRPF6)存在预测的结合位点。课题组前期通过Hybrid-PCR/mi RNA靶基因筛选技术发现一种PRPF6可能作为mi R-134的靶基因参与卵巢癌紫杉醇耐药的调节,但尚无PRPF6在卵巢癌中的研究。PRPF6是剪切蛋白复合体家族成员之一,主要参与调控RNA的可变剪切。多项研究表明PRPF6可介导m RNA的可变剪切促进结肠癌、肝细胞癌和膀胱癌的发展。因此我们推测PRPF6可能参与调控SNHG16的可变剪切介导卵巢癌紫杉醇耐药的调节,但目前尚未见关于此机制的研究报道本课题重点研究PRPF6、SNHG16-L和SNHG16-S在卵巢癌组织及细胞中的表达,分析其与卵巢癌临床病理生物学特征之间的关系,研究其对卵巢癌恶性生物学行为和紫杉醇耐药的影响,揭示其在卵巢癌中的分子机制,为寻找逆转卵巢癌发生发展和化疗耐药的关键因子提供理论和实验基础,对寻找治疗靶点具有重要的科学价值。研究方法:1、通过ENSEMBL网站比对SNHG16-L/S的序列差异,通过Real-Time PCR检测SNHG16-L和SNHG16-S在卵巢癌组织及细胞系中的表达,进而分析其与卵巢癌临床病理生物学特征的关系。2、构建过表达SNHG16-L和SNHG16-S的卵巢癌细胞,通过CCK8、克隆形成实验、Transwell、细胞凋亡和Western Blot实验检测调控SNHG16-L/S表达对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、EMT和紫杉醇耐药的影响。3、通过生物信息学预测SNHG16可能结合的转录因子及其靶基因。通过荧光原位杂交(FISH)和免疫荧光(IF)检测SNHG16、CEBPB和GATA3在卵巢癌细胞中的定位。通过RNA免疫共沉淀(RIP)实验验证SNHG16-L/S和CEBPB蛋白之间的结合作用。Western Blot实验检测过表达SNHG16-L和CEBPB对GATA3蛋白表达的影响。利用染色质免疫共沉淀(CHIP)检测CEBPB蛋白与GATA3启动子之间的结合关系。双荧光素酶报告基因检测过表达CEBPB和过表达SNHG16-L对GATA3转录活性的影响。通过Transwell、CCK8和Western Blot实验进行功能回复检测SNHG16-L和GATA3对细胞迁移、侵袭、EMT和紫杉醇耐药的影响。4、通过生物信息学预测SNHG16-L可能与PRPF6结合。通过免疫组化(IHC)和Real-Time PCR检测PRPF6蛋白在人正常卵巢组织和卵巢癌组织及相关细胞系中的表达,进而分析其与卵巢癌临床病理生物学特征的关系。5、构建沉默PRPF6表达和过表达PRPF6的卵巢癌细胞模型,通过CCK8、克隆形成实验、Transwell、细胞凋亡和Western Blot实验检测不同PRPF6表达水平对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、EMT和紫杉醇耐药的影响。构建沉默PRPF6表达的荷瘤鼠模型,体内实验检测沉默PRPF6对肿瘤增殖的影响,并通过免疫组化检测紫杉醇耐药标志蛋白β-tubulin III在裸鼠组织中的表达6、通过Real-Time PCR检测不同PRPF6表达水平对SNHG16-L和SNHG16-S的调控。利用PRPF6抗体在SKOV3-TR30细胞的RIP验证PRPF6蛋白和SNHG16pre-m RNA、SNHG16-L、SNHG16-S之间的结合作用。Transwell、CCK8和Western Blot实验进行功能回复检测PRPF6/SNHG16-L/GATA3轴对细胞迁移、侵袭、EMT和紫杉醇耐药的影响。结果:1、ENSEMBL注释发现,SNHG16的转录本SNHG16-001(SNHG16-L)和SNHG16-003(SNHG16-S)差别在于exon 1的有无。Real Time-PCR结果表明与卵巢癌化疗敏感组织相比,SNHG16-L在卵巢癌化疗耐药组中表达降低,而SNHG16-S在卵巢癌化疗耐药组中表达升高(P<0.05)。SNHG16-L和SNHG16-S与FIGO分期密切相关,但二者均与患者的年龄、和组织分化和淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。与SKOV3细胞相比,SNHG16-L在SKOV3-TR30细胞中表达降低,而SNHG16-S在SKOV3-TR30中表达升高(P<0.05)。2、在SKOV3-TR30中过表达SNHG16-L,在SKOV3中过表达SNHG16-S,结果发现,过表达SNHG16-L后细胞增殖、迁移、侵袭能力和紫杉醇耐药性降低,细胞凋亡率增加,过表达SNHG16-S后细胞增殖、迁移、侵袭能力和紫杉醇耐药性增高,细胞凋亡率降低(P<0.05)。Western Blot实验结果显示:过表达SNHG16-L可上调E-cadherin,下调N-cadherin、β-tubulin III和Vimentin蛋白的表达,而过表达SNHG16-S使E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin、β-tubulin III和Vimentin蛋白表达上调(P<0.05)。3、生物信息学预测SNHG16可能与CEBPB蛋白结合调控GATA3的转录。FISH和IF结果证实SNHG16、CEBPB和GATA3均定位于细胞核。RIP实验结果表明:CEBPB蛋白可与SNHG16-L结合(P<0.05),与SNHG16-S不具有结合作用(P>0.05)。CHIP实验证实:CEBPB可与GATA3启动子区-898-907bp(TTTATACAAT)结合。双荧光素酶报告基因检测结果显示:CEBPB可与GATA3启动子结合,且过表达CEBPB可激活GATA3的转录(P<0.05);SNHG16-L可抑制CEBPB对GATA3转录活性的调控(P<0.05)。Western Blot实验结果提示:过表达CEBPB可逆转过表达SNHG16-L对GATA3的抑制作用(P<0.05)。回复实验结果证实:过表达GATA3可逆转过表达SNHG16-L对细胞迁移、侵袭能力和紫杉醇耐药性的抑制(P<0.05)。Western Blot实验结果显示:过表达GATA3逆转了过表达SNHG16-L对E-cadherin的促进作用和GATA3、N-cadherin、β-tubulin III、Vimentin蛋白的抑制作用(P<0.05)。4、Cat RAPID Omics网站预测发现PRPF6蛋白可能与SNHG16-L的外显子1区152-455bp处结合。IHC结果表明PRPF6主要定位于细胞核,与正常卵巢组织相比,PRPF6在卵巢浆液性癌组织中高表达,且在卵巢化疗耐药组织中表达高于化疗敏感组织(P<0.05)。PRPF6的高表达与FIGO分期晚密切相关(P<0.05),但与患者的年龄、组织分化和淋巴结转移无关(P>0.05)。PRPF6在人卵巢浆液性癌细胞系SKOV3、A2780、OVCAR-3、CAOV-3、HEY细胞中表达均高于人正常卵巢细胞HOSEpi C。在卵巢癌细胞系中,SKOV3表达量最高,而在卵巢癌紫杉醇耐药细胞SKOV3-TR30中的表达明显高于SKOV3(P<0.05)。5、我们在SKOV3中过表达PRPF6,在SKOV3-TR30中沉默PRPF6。结果表明:敲低PRPF6后细胞增殖、迁移、侵袭能力和紫杉醇耐药性降低,细胞凋亡率增加;过表达PRPF6后细胞增殖、迁移、侵袭能力和紫杉醇耐药性增高,细胞凋亡率降低(P<0.05)。Western Blot实验结果显示:敲低PRPF6可上调E-cadherin,下调N-cadherin、β-tubulin III和Vimentin蛋白的表达(P<0.05)。裸鼠成瘤实验证实,沉默PRPF6表达,裸鼠皮下移植瘤的增殖能力降低,移植瘤组织中β-tubulin III表达降低(P<0.05)。6、Real-time PCR检测结果显示:沉默PRPF6使SNHG16-S表达下降,SNHG16-L表达上调;过表达PRPF6,SNHG16-S表达升高,SNHG16-S表达降低(P<0.05)。RIP实验结果证实:PRPF6蛋白可与SNHG16 pre-m RNA和SNHG16-L结合(P<0.05),而与SNHG16-S不结合(P>0.05)。回复实验结果证实:过表达SNHG16-L可逆转过表达PRPF6对细胞迁移、侵袭能力和紫杉醇耐药性的促进作用(P<0.05)。Western Blot实验结果表明:过表达SNHG16-L可逆转过表达PRPF6对GATA3、N-cadherin、β-tubulin III和Vimentin蛋白促进作用及E-cadherin蛋白抑制作用,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1、SNHG16-L在卵巢癌化疗耐药组织中低表达,而SNHG16-S在化疗耐药组织中高表达,二者的表达水平均与患者的FIGO分期密切相关,而与年龄、组织分化和淋巴结转移无关。2、SNHG16-L抑制卵巢癌恶性生物学行为和紫杉醇耐药,SNHG16-S作用与之相反。3、SNHG16-L可结合CEBPB蛋白抑制GATA3转录介导卵巢癌恶性生物学行为和紫杉醇耐药。4、PRPF6在卵巢浆液性癌组织中呈高表达,尤其在卵巢浆液性癌化疗耐药组织中表达更高。PRPF6的高表达水平与患者的FIGO分期晚密切相关,与年龄、组织分化和淋巴结转移无关。5、PRPF6促进卵巢癌恶性生物学行为和紫杉醇耐药。6、PRPF6通过调控SNHG16 pre-m RNA的可变剪切,下调SNHG16-L,上调GATA3表达促进卵巢癌恶性生物学行为和紫杉醇耐药。