研究背景肝细胞癌是临床上常见的恶性肿瘤,居恶性肿瘤的第5位,在全世界与肿瘤相关的死亡中排第3位。肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要组织学亚型,占原发性肝癌的90%,遗传和表观遗传学改变,慢性乙型病毒感染或丙型肝炎病毒感染,黄曲霉毒素暴露,吸烟,肥胖和糖尿病是肝癌的主要危险因素,肝癌预后不良的原因主要是由于高发生率的肿瘤复发和转移。目前,移植是治疗HCC的最有效方法,但由于肿瘤负担或肝功能不良,超过70%的晚期病例不适合移植。晚期不能耐受uuouuuuu手术的患者主要采取化疗,多靶点激酶抑制剂索拉非尼是FDA批准的一线靶向药物,但是也只能为晚期肝癌患者提供2.8个月的生存获益,此外由于不良反应和耐药性,使得其治疗效果尚不满意,因此努力寻找有效的药物和最优化的治疗方法是当前的研究重点。BRD4全称为bromodomain-containing protein 4,即溴结构域蛋白4,属于BET家族成员。BET溴结构域(bromodomain and extra-terminal domain)包含四种蛋白,即BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。BET具有保守的模块化结构:包括两段N-末端串联BRD效应模块(BD1和BD2),一段额外的末端基团(ET),几组保守的区域(A,B,SEED区域)和C-末端区域(CTM)。含溴结构域的蛋白质4(BRD4)是BET家族中最重要的成员,并深入参与表观遗传学的调控。BRD4蛋白可以通过其溴结构域结合整个细胞周期中的乙酰化组蛋白,并通过募集不同的转录调节因子,来调节靶基因的表达,另外,BRD4蛋白能够与RNA聚合酶II(Pol II),正向转录延长因子(Positive transcription elongation factor,P-TEFb)结合来调节癌基因(如MYC基因等)的转录过程,从而调控细胞的增殖与凋亡。有研究显示,BRD4的表达失调与肺癌、血液系统肿瘤、乳腺癌、结肠癌以及肝癌等多种癌症疾病的形成有关。这些发现表明,BRD4在肿瘤发生和发展中起重要作用,靶向BRD4可能是一种有前途的癌症治疗策略。JQ1是BET蛋白的小分子抑制剂,可与BET溴结构域乙酰化赖氨酸残基竞争性结合,从而阻断含溴结构域的蛋白质(BRD)的功能。JQ1已经在多种癌症中(如多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、乳腺癌等)均观察到有希望的抗增殖作用和临床意义,本研究通过观察JQ1联合索拉非尼对肝癌细胞株的增殖抑制作用,并探讨其可能的机制,为肝癌的临床治疗提供理论基础。目的通过将JQ1与索拉非尼分别作用以及联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,在不同的时间段观察JQ1是否增强了索拉非尼对Hep G2和Bel-7402的增殖抑制、细胞周期抑制、凋亡抑制以及对凋亡蛋白Bcl-2、BIM和癌基因c-MYC的蛋白的表达影响,来阐明BRD4抑制剂JQ1是否能增加索拉非尼在肝癌细胞的增殖抑制。方法(1)分别使用5个浓度梯度的(0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM)的JQ1和5个浓度梯度(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)的索拉非尼作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,MTT法分别检测不同浓度药物对肝癌细胞的增殖抑制率,绘制浓度-抑制率曲线图,计算出JQ1和索拉非尼分别作用于两种肝癌细胞的IC50值,以便选取后续实验所需药物浓度。(2)分别选用合适浓度的JQ1、索拉非尼以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,24h及48h后MTT法检测各组药物对肝癌细胞的增殖抑制率,并且计算出两种药物的联合用药指数CI。(3)JQ1和索拉非尼分别作用于以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,流式细胞仪检测各组对肝癌细胞细胞周期的影响。(4)JQ1和索拉非尼分别作用于以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,流式细胞仪检测各组对肝癌细胞凋亡率的影响。(5)JQ1和索拉非尼分别作用于以及二者联合作用于Hep G2和Bel-7402肝癌细胞,Western-Blot检测凋亡蛋白Bcl-2,BIM,癌基因c-MYC的表达。结果(1)MTT实验结果显示JQ和索拉非尼药物分别呈剂量依赖性抑制Hep G2和Bel-7402肝癌细胞的增殖。在Hep G2中,JQ1的IC50为3.00±0.95(μmol/L)为,索拉非尼的IC50为11.43±2.60(μmol/L)为;在Bel-7402中,JQ1的IC50为2.60±0.65(μmol/L),索拉非尼的IC50为11.68±2.19(μmol/L)。与JQ1和索拉非尼药物单独作用相比,JQ1与索拉非尼联合作用对细胞增殖抑制率明显增加,JQ1可以增加索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制,联合用药指数CI显示两种药物为协同作用。(2)流式细胞周期实验显示,在Hep G2和Bel-7402中,与JQ1和索拉非尼药物单独作用相比,JQ1和索拉非尼联合作用后肝癌细胞G1期细胞增加,而S期肝癌细胞减少,JQ1可以增加索拉非尼对肝癌细胞的周期抑制。(3)流式细胞凋亡实验结果显示,在Hep G2和Bel-7402中,JQ1和索拉非尼联合作用后,肝癌细胞的凋亡率较JQ1和索拉非尼药物单独作用时明显增加,JQ1可以增加索拉非尼在肝癌细胞中的凋亡作用。(4)Western Blot结果显示在Hep G2和Bel-7402中,JQ1可以增加索拉非尼对凋亡Bcl-2蛋白,癌基因c-MYC蛋白的抑制,以及促进凋亡BIM蛋白的表达。结论本结果表明一定浓度的JQ1能增强索拉非尼对肝癌细胞株的增殖抑制与诱导凋亡作用,其作用机制可能与改变细胞周期分布,下调Bcl-2及c-MYC的表达,上调BIM蛋白的表达有关。