肺癌是当今世界最常见恶性肿瘤之一,近年来炎症因素与肿瘤发生的关系引起了学术界广泛重视,已经成为肿瘤研究的热点和前沿领域。肿瘤坏死因子α（TNF-α）作为一种重要的炎症介质促进炎症反应,调节肿瘤生长。我们前期研究发现黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G1,AFG1）可以诱导TNF-α依赖的肺组织炎症反应,促进肺泡上皮损伤,进而参与肺腺癌的发生;体外给予小剂量TNF-α模拟炎症反应可以诱导肺腺癌细胞的上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）和迁移。高迁移率族蛋白1（High-mobility group box 1,HMGB1）是一个广泛存在于真核生物中的非组蛋白绑定蛋白,分为内源性表达型和外源性分泌型,细胞核表达型HMGB1在维持染色体稳定,DNA复制及基因转录中发挥重要作用,当HMGB1进一步激活可以从细胞核向胞浆转位,进而分泌到细胞外形成具有炎症细胞因子功能的分泌型的HMGB1,这种外源性因子与其常见的受体,如Toll样受体2（Toll-like receptors 2,TLR2）、Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）和晚期糖基化终末产物受体（Receptor for advanced glycation end-products,RAGE）等结合,进而通过多种机制激活下游的NF-κB通路,调节基因表达,调控细胞分裂生长及凋亡,参与炎症反应。近年来,HMGB1作为炎症因子在肺组织炎症反应和肺癌发生发展过程中的作用引起学术界的关注,研究发现,吸烟诱导的肺组织炎症中,外源性分泌型HMGB1可以通过TLR4激活NF-κB通路参与肺组织炎症反应。有关HMGB1在肿瘤发生发展中的作用很多,但研究结果不一,仍有争议,HMGB1在直肠癌、肝癌、间皮瘤、间质瘤等肿瘤中具有促进肿瘤形成的作用,但在子宫内膜癌,胰腺癌等对肿瘤有抑制作用。HMGB1在肺腺癌中的作用研究结果不一致,Zuo Z等报道HMGB1通过抑制CREB和NWASP表达,抑制肺腺癌细胞存活和转移,而Feng A等认为HMGB1高表达与肺腺癌预后差有关。因此HMGB1的复杂作用引起众多学者的关注。近来有研究报道给予IFN-γ和TNF-α可以调控巨噬细胞HMGB1的表达。但是TNF-α依赖的肺组织炎症反应是否/怎样调控肿瘤细胞HMGB1分泌和表达?如何参与肺腺癌的进展?以及在AFG1诱导炎症反应对肺泡上皮损伤过程中HMGB1如何发挥作用,尚不清楚。有鉴于此,本课题拟探讨TNF-α依赖的肺组织炎症反应对HMGB1分泌和表达的影响及其在肺腺癌发生发展中作用;分析TNF-α依赖的肺组织炎症反应中IL-10和HMGB1的相互关系及其对肺腺癌细胞增殖、迁移和浸润的影响;评价黄曲霉毒素G1诱导肺组织炎症反应对HMGB1的影响及其在肺泡上皮细胞损伤中的作用。第一部分:TNF-α依赖的肺组织炎症反应上调HMGB1促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭目的:本研究采用乌拉坦构建TNF-α依赖的小鼠炎症诱导的肺腺癌（Inflammation-driven lung adenocarcinoma,IDLA）模型、人肺腺癌标本和体外培养A549细胞,分别在整体和细胞水平探讨TNF-α依赖的肺组织炎症反应对HMGB1表达和分泌的影响,及其在肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。方法:1.构建乌拉坦诱导的炎症介导的小鼠IDLA模型,并在肿瘤发生前期给予TNF-α中和抗体sTNFR:Fc抑制肺组织炎症反应和肺腺癌发生,观察TNF-α依赖肺组织炎症反应对HMGB1表达的影响,以及与巨噬细胞浸润的关系。2.收集河北省胸科医院经病理诊断明确的肺腺癌临床标本44例,采用免疫组织化学染色和免疫荧光染色,分析肿瘤组织HMGB1和TNF-α表达以及与间质巨噬细胞浸润关系。3.体外培养A549细胞,探讨TNF-α对HMGB1表达和分泌的影响,及其对细胞EMT、增殖、迁移和侵袭的影响。结果:1.乌拉坦诱导的小鼠炎症肺组织和炎症诱导的肺腺癌（IDLA）中HMGB1及受体表达情况在乌拉坦诱导的小鼠肺炎症和炎症诱导的肺腺癌（IDLA）中HMGB1及其受体TLR2和RAGE表达均明显上调（P<0.05）,并伴随着巨噬细胞和腺癌细胞高表达TNF-α;提示在肿瘤发生前期炎症肺组织以及IDLA中,巨噬细胞和肺腺癌细胞分泌TNF-α形成炎症微环境与HMGB1高表达密切相关。2.抑制TNF-α依赖炎症反应对炎症肺组织以及肺腺癌组织中HMGB1、TNF-α、和TLR2表达的影响在IDLA发生前期,给予TNF-α阻断剂sTNFR:Fc抑制肺组织炎症反应以及HMGB1其受体TLR2和RAGE在炎症肺组织表达均明显下降（P<0.05）;肺组织巨噬细胞浸润以及TNF-α表达减少。给予TNF-α阻断剂sTNFR:Fc抑制肺腺癌发生,抑制肿瘤组织HMGB1表达以及核浆转位,同时抑制巨噬细胞浸润（P<0.05）。在IDLA中,TNF-α依赖炎症反应调控HMGB1的表达,炎症反应调控巨噬细胞浸润可能和HMGB1表达具有密切关系。3.人肺腺癌组织中巨噬细胞相关炎症环境与HMGB1、TLR2和TNF-α的表达的关系免疫组化结果显示在人肺腺癌中HMGB1,TLR2,TNF-α表达均高于正常对照肺组织;肺腺癌组织HMGB1高表达与TNF-α表达以及肿瘤间质巨噬细胞浸润呈正相关关系（P<0.05）。4.体外给予TNF-α对A549细胞HMGB1表达和分泌的影响体外实验给予TNF-α处理肺腺癌A549细胞,TNF-α明显促进HMGB1在细胞核、细胞浆中表达,以及在细胞外的分泌（P<0.05）;siRNA抑制A549细胞NF-κB通路,TNF-α上调HMGB1作用明显下降（P<0.05）。提示TNF-α通过NF-κB通路上调HMGB1在细胞核中表达以及细胞外分泌。5.TNF-α通过内源性HMGB1对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。使用HMGB1siRNA抑制内源性HMGB1,检测TNF-α刺激对A549细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT的影响。TNF-α能促进细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的作用。克隆形成实验、Transwell、划痕实验及Western Blot显示阻断HMGB1表达抑制细胞增殖、迁移和侵袭,给予TNF-α刺激,其对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响明显下降（P<0.05）。Western Blot结果显示阻断HMGB1表达抑制TNF-α对A549细胞EMT相关蛋白的调控作用（P<0.05）。提示TNF-α通过内源性HMGB1激活促进A549细胞的增殖,迁移和浸润及EMT作用。6.外源性HMGB1对A549细胞的增殖、迁移及侵袭影响克隆实验、Transwell、划痕实验、RT-PCR和Western Blot结果显示给予外源性HMGB1促进A549细胞增殖、迁移和侵袭及EMT。使用siRNA阻断TLR2表达后,外源性HMGB1对于A549细胞增殖、迁移和浸润作用明显受到抑制。使用siRNA阻断HMGB1后,细胞本身增殖、迁移和浸润能力明显下降,外源性HMGB1刺激对细胞增殖、迁移和浸润的影响明显下降。提示外源性HMGB1通过TLR2-内源性HMGB1促进肺腺癌的增殖和进展。以上提示在肺腺癌组织中巨噬细胞浸润以及肿瘤细胞分泌TNF-α与高表达HMGB1具有密切关系。TNF-α依赖的炎症微环境上调HMGB1及受体表达在肺腺癌细胞进展中发挥重要作用,TNF-α通过内源性HMGB1促进肺腺癌的进展。外源性HMGB1通过TLR2及内源性HMGB1促进肺腺癌的进展。第二部分:IL-10通过内源性HMGB1在肺腺癌细胞增殖和进展中作用目的:在第一部分发现TNF-α依赖的肺组织炎症反应调控IL-10的表达基础上,探讨肺腺癌中IL-10和HMGB1的相互调控作用,以及IL-10是否通过HMGB1影响肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及EMT。方法:1.采用免疫组织化学染色检测第一部分中44例人肺腺癌和20例正常对照肺组织中HMGB1、TLR2和IL-10的表达,分析它们的相关性,及与临床资料的联系及预后关系。2.采用RT-PCR方法检测给予HMGB1处理对A549细胞IL-10等炎症相关因子的表达,以及IL-10对HMGB1表达的影响。并探讨IL-10对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及是否通过HMGB1发挥作用。结果:1.人肺腺癌中HMGB1、TLR2、IL-10表达及相关性研究我们采用第一部分的人肺组织标本,免疫组化检测IL-10在肺腺癌组织中的表达情况,并分析其与HMGB1、TLR2表达相关性。发现IL-10在44例肺腺癌中表达比对照组明显升高,HMGB1与IL-10具有明显的正相关性（r=0.7167,P<0.0001）。IL-10与HMGB1表达与淋巴结转移、TNM分期均呈明显正相关关系,TLR2与TNM分期呈弱相关关系,与淋巴结转移无相关关系。HMGB1和IL-10的阳性表达均与患者总体生存率呈明显负相关关系（P均<0.05）,与患者的不良预后密切相关。而TLR2的表达与患者总体生存率没有明显关系。2.外源性HMGB1和IL-10在A549细胞中相互作用在A549细胞中给予HMGB1刺激,RT-PCR结果显示炎症相关因子IL-10和TNF-α表达明显升高（P<0.05）。而体外给予IL-10刺激A549细胞,明显上调TNF-α和IL-6表达,但是对HMGB1表达没有影响。3.IL-10对A549细胞增殖,迁移,侵袭及EMT的影响给予IL-10刺激A549细胞,克隆形成、Transwell、划痕实验和Western Blot结果显示IL-10对细胞具有促增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05）。RT-PCR和Western Blot检测结果显示IL-10能明显促进细胞EMT作用（P<0.05）。4.IL-10通过内源性HMGB1对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响采用siRNA技术敲除HMGB1后,给予IL-10刺激,IL-10对于细胞的增殖、迁移和侵袭影响明显受到抑制（P<0.05）。结果提示,IL-10可以通过内源性HMGB1而促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。综上,人肺腺癌中肿瘤细胞IL-10高表达与HMGB1且具有明显正相关性,与患者TNM分期和淋巴结转移和不良预后具有明显相关性。外源性HMGB1上调肿瘤细胞表达IL-10,IL-10通过内源性HMGB1促进肿瘤细胞细胞EMT、增殖、迁移和侵袭。第三部分:HMGB1在黄曲霉毒素G1诱导的TNF-α依赖的肺组织炎症对肺泡上皮DNA损伤的影响目的:本研究团队前期研究发现,长期经口灌胃实验动物食物中污染的黄曲霉毒素G1（AFG1）可以诱导小鼠肺腺癌的发生。在肺癌发生前期,AFG1诱导TNF-α依赖的肺组织炎症反应,促进AFG1在肺泡上皮细胞的活化,加重靶细胞DNA损伤,可能在细胞癌变中发挥重要作用。本研究的第一,第二部分发现TNF-α依赖的肺组织炎症反应可以上调HMGB1在肺腺癌的增殖和浸润中发挥重要作用;其分泌到细胞外分泌型HMGB1和TNF-α可以组成细胞因子网络,通过细胞内HMGB1的作用,而促进肺腺癌细胞的增殖和迁移。那么,AFG1诱导TNF-α依赖肺组织炎症反应是否也调控HMGB1表达?HMGB1在AFG1诱导肺泡上皮细胞DNA损伤中发挥什么作用?目前尚未确定。因此本部分实验我们采用AFG1诱导TNF-α依赖肺组织炎症反应模型,以及体外培养正常肺支气管上皮Beas-2b细胞,进一步探讨AFG1诱导TNF-α依赖肺组织炎症反应调控HMGB1表达对肺泡上皮细胞DNA损伤的影响,以期揭示内源性和外源性HMGB1在AFG1诱导肺腺癌发生中的可能作用机制。方法:1.应用Western Blot,RT-PCR,IHC方法检测AFG1诱导的小鼠炎症肺组织和肺腺癌模型中HMGB1及受体、炎症相关因子的表达;应用免疫荧光检测小鼠肺泡上皮细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX的表达。使用TNF-α中和抗体sTNFR:Fc阻断炎症后,检测炎症肺组织中HMGB1及γ-H2AX的表达情况。2.探讨AFG1是否影响HMGB1的表达,我们采用人肺泡上皮细胞Beas-2b,体外给予AFG1刺激24h,分别检测HMGB1的表达和分泌。3.为了进一步探讨分泌型（外源性）HMGB1在AFG1诱导的DNA损伤作用,我们对比AFG1（10μg/ml）和HMGB1（20ng/ml）联合作用与AFG1单独刺激对Beas-2b细胞损伤的影响。我们采用siRNA敲低HMGB1后,给予AFG1作用,检测Beas-2b细胞DNA损伤相关指标γ-H2AX和细胞ROS、凋亡的变化,探讨内源性HMGB1在AFG1诱导肺泡上皮细胞损伤中的作用。结果:1.HMGB1,TLR2和RAGE在AFG1诱导的肺组织炎症反应及肺腺癌中的表达在AFG1诱导的小鼠肺炎症和肺腺癌中HMGB1、TLR2和RAGE表达明显高于对照组（P<0.05）。提示在AFG1诱导的小鼠肺炎症和肺腺癌中HMGB1高表达,可能在肺腺癌发生中起重要作用。2.AFG1诱导TNF-α依赖肺组织炎症反应对HMGB1表达的影响给予TNF-α中和抗体sTNFR:Fc阻断AFG1诱导炎症后,肺组织中HMGB1、TLR2、p-NF-κB及炎症相关因子表达明显低于AFG1单独诱导的肺炎症组织（P<0.05）。给予sTNFR:Fc阻断AFG1诱导炎症后,肺泡上皮细胞DNA损伤标志物γ-H2AX表达均明显受到抑制。进一步提示AFG1诱导TNF-α依赖的肺组织炎症反应可以上调HMGB1的表达,与肺泡上皮损伤密切相关。3.AFG1对肺泡上皮细胞损伤和HMGB1表达及分泌的影响为了进一步探讨AFG1诱导肺组织炎症反应中,AFG1是否影响HMGB1的表达,我们采用人肺泡上皮细胞Beas-2b,体外给予AFG1刺激24h,分别检测HMGB1的表达和分泌。给予AFG1刺激明显上调TNF-α、IL-6、IL-10和HMGB1mRNA的表达（P<0.05）。Western Blot和ELISA检测结果显示,AFG1刺激促进HMGB1在细胞中表达和分泌（P<0.05）。免疫荧光结果显示AFG1诱导肺泡上皮细胞HMGB1发生核浆转位。实验结果提示AFG1引起细胞损伤过程中,HMGB1表达及分泌升高,促进HMGB1从核内转到细胞浆,再分泌到细胞外发挥作用。4.外源性HMGB1对AFG1引起的Beas-2b细胞损伤的影响在体外实验中应用Beas-2b细胞给予AFG1刺激,引起细胞内和细胞上清中HMGB1升高,γ-H2AX表达升高（P<0.05）。再给予外源性HMGB1与AFG1联合刺激,γ-H2AX表达比单加AFG1刺激明显下降（P<0.05）,给予HMGB1刺激明显上调TLR2和p-NF-κB,而单独给予AFG1作用对TLR2和p-NF-κB没有影响。提示外源性HMGB1可能通过TLR2和NF-κB途径抑制AFG1对肺泡上皮损伤。使用siRNA敲低TLR2和NF-κB后,HMGB1和AFG1联合作用明显上调γ-H2AX的表达（P<0.05）。流式结果显示AFG1促进ROS和凋亡,AFG1+HMGB1联合刺激明显降低ROS和细胞凋亡,敲除TLR2和NF-κB后,HMGB1和AFG1联合作用对细胞ROS生成及凋亡诱导作用明显增强（P<0.05）。提示外源性HMGB1通过TLR2受体激活NF-κB通路抑制AFG1诱导的肺泡上皮细胞损伤。5.内源性表达型HMGB1在AFG1诱导Beas-2b细胞DNA损伤中的作用Western Blot结果显示采用siRNA敲低HMGB1后,给予AFG1处理后,AFG1明显促进HMGB1敲除细胞γ-H2AX表达（P<0.05）。免疫荧光结果显示AFG1处理后,HMGB1敲除组细胞核表达γ-H2AX的阳性细胞数明显多于对照组。流式细胞仪检测结果显示,敲低HMGB1可以增加细胞内ROS含量和细胞凋亡率;而给予AFG1明显增加Beas-2b细胞ROS含量以及细胞凋亡率（P<0.05）。结果提示内源性HMGB1在AFG1诱导细胞损伤中发挥重要作用。综上,在AFG1诱导的小鼠肺炎症和肺腺癌上调HMGB1、TLR2和RAGE。给予TNF-α阻断剂抑制AFG1诱导肺组织炎症反应可以抑制HMGB1的表达。体外给予AFG1促进肺泡上皮细胞Beas-2b细胞HMGB1的表达和分泌。外源性分泌型和内源性HMGB1可以保护AFG1导致的Beas-2b细胞DNA损伤。结论:1.HMGB1及受体在TNF-α依赖的炎症诱导的小鼠肺腺癌高表达;肺腺癌微环境巨噬细胞浸润和TNF-α表达与人肺组织HMGB1表达密切相关。体外给与TNF-α激活A549细胞NF-κB通路上调HMGB1的表达和分泌;TNF-α和外源性HMGB1可以通过内源性HMGB1促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭。2.在人肺腺癌标本中,肿瘤细胞IL-10高表达与HMGB1具有明显正相关性,与患者TNM分期和淋巴结转移和不良预后具有明显相关性。外源性HMGB1可以上调肿瘤细胞表达IL-10,给予IL-10刺激可以通过HMGB1促进A549细胞EMT、增殖、迁移和侵袭。3.在AFG1诱导的TNF-α依赖肺炎症和肺腺癌中HMGB1、TLR2和RAGE表达明显升高。体外给予AFG1促进肺泡上皮细胞Beas-2b细胞HMGB1的表达和分泌。外源性分泌型和内源性HMGB1可以保护AFG1导致的Beas-2b细胞DNA损伤。