论文部分内容阅读
目的:脂肪细胞和成骨细胞起源于同一祖细胞-间充质干细胞(MSCs),因而脂肪细胞和成骨细胞的分化存在相互制约的平衡关系。近年来研究表明脂肪细胞和成骨细胞的分化受表观遗传机制包括miRNA的调控。本研究将探讨miR-30e对脂肪细胞与成骨细胞分化的影响及其作用机制。方法 1.miRNA芯片技术检测miRNA在小鼠骨髓MSCs的脂肪细胞分化和成骨细胞分化过程中的差异表达,Real-Time PCR检测几种不同前体细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化过程中miR-30e的表达变化。2.在3T3-L1细胞中增强miR-30e表达或抑制miR-30e表达,检测miR-30e对3T3-L1细胞增殖与分化的影响;在MC3T3-E1细胞中抑制miR-30e表达,检测miR-30e对成骨细胞分化的影响。3.结合生物信息学方法和双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-30e的靶基因。通过基因功能缺失性研究探索候选靶基因调节细胞分化的作用机制。结果 1.通过miRNA芯片技术筛选出若干在小鼠骨髓MSCs诱导成脂后表达显著上升,同时在诱导成骨后表达下降的miRNA,其中miR-30e变化较为显著。进一步研究显示miR-30e在C3H10T1/2与3T3-L1细胞诱导成脂后表达上升,在ST2与MC3T3-E1细胞诱导成骨后表达下降。2.在3T3-L1细胞内增强miR-30e表达,3T3-L1细胞生长受抑制而分化加强,脂肪细胞分化关键转录因子PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和表征基因aP2等表达显著升高。相反,如果抑制3T3-L1细胞内源性miR-30e表达则可促进3T3-L1细胞增殖并抑制3T3-L1分化为成熟脂肪细胞,脂肪细胞特异性基因表达下降。在MC3T3-E1细胞,抑制内源性miR-30e表达促进了前成骨细胞MC3T3-E1分化成熟,Runx2、Osx、Osteocalcin、ALP和BSP等成骨细胞特异性基因表达显著升高。3.通过TargetScan等软件预测了miR-30e的候选靶基因Runx2、Wnt7b和Lrp6,成功构建了包含miR-30e应答序列的Runx2、Wnt7b和Lrp6的3’UTR的重组报告载体,荧光素酶报告基因测定证实了 miR-30e能够结合Lrp6的3’UTR而阻断其表达。在3T3-L1细胞内下调Lrp6表达后,β-catenin/TCF信号减弱。细胞分化研究进一步证明Lrp6表达下调可以促进3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞,脂肪细胞分化关键转录因子PPARy、C/EBPα、C/EBPβ和表征基因aP2等的表达显著升高。结论 1.miR-30e在脂肪细胞分化过程中表达上升,而在成骨细胞分化过程中表达下降。2.miR-30e可以抑制前脂肪细胞增殖而促进脂肪细胞分化,并抑制成骨细胞分化。3.Lrp6为miR-30e的靶基因,Lrp6在脂肪细胞与成骨细胞分化中具有重要的作用,为脂肪细胞分化的负性调控因子,miR-30e通过靶向抑制Lrp6表达而促进脂肪细胞分化。