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目的本研究旨在利用D-半乳糖（D-gal）诱导的H9c2心肌细胞衰老模型,模拟体内心肌细胞衰老时产生的线粒体损伤,探讨褐藻胶寡糖（AOS）延缓心肌细胞衰老的作用,并研究microRNA-153-3p（miR-153-3p）参与AOS延缓心肌细胞衰老的潜在分子机制。方法1.D-gal诱导H9c2心肌细胞衰老模型的建立。H9c2心肌细胞采用不同浓度D-gal处理48h。根据SA-β-gal染色、Annexin V-FITC/PI双染法、CCK-8等实验结果选择D-gal的最适造模浓度,构建D-gal诱导的H9c2心肌细胞衰老模型。2.AOS对D-gal诱导的H9c2心肌细胞的保护作用。选取状态良好的H9c2心肌细胞分为Control组、D-gal组、D-gal+AOS组,培养24h后,D-gal组及D-gal+AOS组在给予D-gal（40g/L）处理48h构建衰老模型,随后D-gal+AOS组予以AOS（100μg/mL）继续处理48h,Control组仅予以同步换液。实验结束后,采用SA-β-gal染色检测心肌细胞衰老情况;ROS试剂盒检测心肌细胞中ROS含量;JC-1检测心肌细胞线粒体膜电位变化;Western blot检测p53、p21以及PGC-1α的蛋白表达;RT-qPCR检测D-gal诱导的各组心肌细胞在AOS处理前后miR-153-3p和PGC-1α的基因表达。3.miR-153-3p参与AOS延缓D-gal诱导的H9c2心肌细胞衰老。通过Target Scan数据库预测与miR-153-3p相互作用的基因。H9c2心肌细胞转染miR-153-3p mimic。采用RT-qPCR和Western blot方法验证miR-153-3p与PGC-1α的相互作用。取生长良好的心肌细胞随机分为6组:Control组、AOS组、D-gal组、D-gal+AOS组、D-gal+AOS+miR-NC（miR-NC）组、D-gal+AOS+miR-153-3p mimic（miR-153-3p mimic）组。D-gal、D-gal+AOS、miR-NC和miR-153-3p mimic组以D-gal构建细胞衰老模型;随后miR-NC组和miR-153-3p mimic组分别转染miR-NC和miR-153-3p mimic;AOS、D-gal+AOS、miR-NC和miR-153-3p mimic组继续给予AOS处理48h,期间Control组仅给予同步换液。处理结束后,采用RT-qPCR方法检测转染miR-153-3p mimic后,D-gal诱导的H9c2心肌细胞在AOS处理前后各组细胞内miR-153-3p和PGC-1α的表达情况;检测各组细胞衰老情况、ROS含量以及线粒体膜电位变化;检测各组细胞衰老相关蛋白及PGC-1α、Tfam、Nrf1的蛋白表达。结果1.AOS对D-gal诱导的H9c2心肌细胞的保护作用。不同浓度的D-gal持续作用48h时后,与Control组相比,CCK-8结果显示心肌细胞活力随D-gal浓度增加而明显下降（p<0.01）;SA-β-gal染色结果显示衰老心肌细胞数呈D-gal浓度依赖性地增加（p<0.01）;流式细胞术结果显示D-gal浓度为60g/L时才出现细胞凋亡率显著增加（p<0.01）。基于以上实验结果,确定后续实验拟采用40g/L的D-gal构建细胞衰老模型。与D-gal组相比,D-gal+AOS组细胞经AOS处理后明显改善了细胞衰老情况,衰老细胞数量减少（p<0.01）,ROS水平降低,线粒体膜电位恢复。Western blot结果显示,D-gal+AOS组衰老相关蛋白表达较D-gal组明显下降（p<0.01）,PGC-1α表达增加（p<0.01）。进一步PCR结果显示,AOS处理下调了miR-153-3p的表达（p<0.01）,同时上调了PGC-1α表达（p<0.01）。2.AOS通过下调miR-153-3p表达延缓D-gal诱导的H9c2心肌细胞衰老。SA-β-gal染色结果显示,与Control组相比,D-gal处理促进了心肌细胞衰老（p<0.01）;与D-gal组相比,AOS减少了衰老细胞数（p<0.01）;与miR-NC组相比,过表达miR-153-3p增加了衰老细胞比例（p<0.01）。JC-1染色数据显示,D-gal组心肌细胞线粒体膜电位较正常组明显下降;AOS处理后细胞线粒体膜电位升高;与miR-NC组相比,过表达miR-153-3p,导致线粒体损伤,促使miR-153-3p mimic组心肌细胞线粒体膜电位明显下降。ROS检测结果显示,与Control组相比,D-gal处理后ROS水平上升（p<0.01）;AOS处理则降低了ROS水平（p<0.01）;与miR-NC组相比,miR-153-3p mimic组ROS水平显著上升（p<0.01）。RT-qPCR数据显示,D-gal组miR-153-3p表达较正常组显著升高（p<0.01）,D-gal+AOS组表达较D-gal组表达明显减少（p<0.01）。进一步结果显示,miR-153-3p mimic组miR-153-3p基因表达较miR-NC组显著增加（p<0.01）。Target Scan数据库预测miR-153-3p可调控PGC-1α表达。转染miR-153-3p mimic、miR-NC后,RT-qPCR数据表明,过表达miR-153-3p后细胞中该基因表达显著增加（p<0.01）,PGC-1α基因和蛋白表达则明显减少（p<0.01）。Western blot结果显示,与Control组相比,D-gal处理后细胞衰老相关蛋白表达明显上调（p<0.01）,相反,线粒体生物合成因子则表达减少（p<0.01）;AOS处理则下调了衰老相关蛋白表达（p<0.01）,上调了线粒体生物合成因子表达（p<0.01）。与miR-NC组相比,miR-153-3p显著增加了衰老相关蛋白表达（p<0.01）,下调了线粒体生物合成因子表达（p<0.05,p<0.01）。结论AOS能够延缓D-gal诱导的H9c2心肌细胞衰老,其机制可能与AOS抑制衰老心肌细胞中的miR-153-3p表达,改善心肌细胞线粒体生物合成功能有关。