目的随着环境气候的改变,以及社会经济的发展,免疫系统反应过度引起的自身免疫性疾病、变态反应性疾病等日益增多,严重危害人类的身体健康,影响生活质量,因此需要大量的治疗此类疾病的药物。目前常用的免疫抑制药物包括糖皮质激素、钙调磷酸酶、抗组胺类药物等。因其具有毒副作用大、价格昂贵等缺点,限制了其临床应用。中国传统中药土槿皮中的有效成分土槿乙酸具有良好的免疫调节活性,但其作用机制尚未完全阐明,且长期应用仍有一定毒副作用。因此本研究首先以土槿乙酸为母核,对其进行结构修饰得到衍生物,然后评价其抑制淋巴细胞增殖活性,最后研究探讨土槿乙酸对迟发型超敏反应(DTH)模型小鼠的治疗作用及可能的作用机制。以期得到高效、低毒的新型药物,为研制新型免疫抑制剂奠定基础。方法1.土槿乙酸C-18位为裸露的羧基,应用成酯或成酰胺的方法,在C-18引入带N,N-二烷基叔胺结构的脂肪族醇或胺形成新的衍生物;2.水解C-4位的乙酰基,与带N,N-二烷基叔胺结构的脂肪族醇或胺反应,得到新的化合物;3.设计吲哚类模拟土槿乙酸的化合物;4.采用MTT法体外筛选土槿乙酸衍生物对T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖活性的影响,同时进行淋巴细胞毒性分析并与临床商用的免疫抑制剂霉酚酸酯进行比较。5.研究土槿乙酸对DNFB诱导的DTH小鼠的药效学作用;6.采用RT-PCR、Western Blot的方法检测土槿乙酸对DTH小鼠脾脏及耳部组织中相关因子及信号通路的调节作用。结果共合成了 19个衍生物,其中C-18结构改造得到了 10个化合物,C-4位去乙酰基后得到了5个化合物,吲哚系列合成了4个化合物,所有化合物结构都经过1H-NMR、HR-ESI-MS检测。药理结果显示,所得衍生物对正常淋巴细胞的毒性均较低,部分衍生物对ConA诱导的T淋巴细胞的抑制活性较好,水解乙酰基得到的衍生物药理活性显著低于未水解的衍生物。土槿乙酸口服给药后,能改善由于DNFB刺激引起的体重下降,可以降低胸腺指数与脾脏指数,抑制免疫器官的肿大,减小耳肿胀度,改善耳组织的炎症反应。土槿乙酸能够下调炎症因子IL-1β、TNF-α的基因表达,抑制炎症反应的病症的加剧;下调IL-22及IL-22R表达,抑制其产生的免疫应答;上调抑制性细胞因子IL-10、IL-I0R的表达,说明土槿乙酸能发挥免疫抑制作用,减轻炎症反应,缓解体内免疫亢进状态;此外,上槿乙酸还能下调热休克蛋白HSP27的基因表达,调节其对外界刺激的应激状态,使机体迅速适应外界干扰,并起到防御作用。免疫印迹结果显示,土槿乙酸能明显抑制p38MAPK信号通路中关键环节MAPKAPK-2的磷酸化活性表达,上调PPARγ的蛋白水平,通过多个作用靶点,从而调节机体免疫-炎症反应网络。结论土槿乙酸C-18位引入带有N,N-二烷基结构的脂肪族胺或醇具有较好的药理活性,C-4位乙酰基水解后得到的酯或酰胺类结构的活性低于未水解的衍生物,提示C-4位的乙酰基是必需的。土槿乙酸对DTH小鼠具有较好的治疗作用,因此土槿乙酸作为中药提取单体,具有广阔的研究前景,深入研究开发新型的土槿乙酸衍生物,解决其毒性大,溶解度差的问题,得到新型的抗炎及免疫调节药物,将是今后的工作重点。