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疯草(Locoweed)是含有生物碱苦马豆素(swainsonine,SW)的豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的统称,广泛分布于美国、中国、加拿大等国家。动物过量采食会发生疯草中毒病,造成严重的经济损失。链格孢属波状芽管孢组(Alternaria Sect.Undifilum spp)疯草内生真菌可产生SW,与疯草毒性紧密相关。研究该类真菌合成SW的路径和调控机理,可为从生物控制角度降低或消除疯草的毒性奠定基础。但该类真菌合成SW的机理仍未阐明,目前仅发现酵母氨酸还原酶基因参与疯草内生真菌中SW合成的调控,其SW合成机理可能与豆类丝核菌和金龟子绿僵菌相似。直立黄芪(Astragalus adsurgens Pall)在中国被作为人工牧草广泛种植,该植物病原真菌Alternariagansuense与疯草内生真菌形态相似,遗传进化关系紧密,但该真菌是否产生SW仍未见报道。本研究对直立黄芪中产SW真菌进行分离和鉴定,为进一步阐明该真菌与直立黄芪、疯草内生真菌的关系,及直立黄芪的安全利用提供依据。LAAO可能参与L-赖氨酸降解,KS基因可能参与SW合成过程的调控,但这些基因在疯草内生真菌中的具体功能仍未确定,本研究对来自直立黄芪和不同种疯草产SW真菌的LAAO、KS基因进行检测和分析,为进一步确定其功能提供依据。本研究还对经UV、EMS和NTG诱变处理的疯草内生真菌菌株进行了筛选,筛选SW合成与对照株差异显著且产率稳定的突变菌株,为进一步筛选疯草内生真菌中与SW合成相关的差异表达基因提供菌种材料。本研究的主要内容如下:1.对直立黄芪植物组织中的真菌进行分离,检测各分离菌株菌丝中是否含有SW。对产SW菌株ITS、GPD和KS等序列进行测定和遗传进化分析。结果表明,从直立黄芪中共分离到43株真菌,其中13株含有SW,但其SW含量仅为0.004±0.046mg·g-1,显著低于疯草内生真菌的SW含量。该13株真菌与己报道的直立黄芪病原真菌甘肃链格孢(Alternaria gansuense)和产SW疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum sp)的亲缘关系最近,根据形态特征和遗传进化分析结果,将其划分到链格孢属波状芽管孢组中,并命名为甘肃波状芽管孢(Alternaria Section Undifilum gansuense)。2.对从直立黄芪和黄花棘豆、变异黄芪、冰川棘豆、茎直黄芪等4种疯草中分离的13株产SW菌株LAAO和KS基因进行检测、序列测定和一致性比较。结果表明,该类真菌LAAO片段长度均为798 bp,KS的片段长度为690 bp或691 bp。12株来自疯草的波状芽管孢内生真菌的LAAO序列完全一致,但从直立黄芪分离出的甘肃波状芽管孢在6个核苷酸位点发生了突变。与已报道的产SW疯草内生真菌Alternaria Section U.oxytropis(KY365741)相比,13株产SW菌株的KS序列在0～11个核苷酸位点发生了突变,导致0～9个氨基酸残基发生突变。其中甘肃波状芽管孢突变的所有位点与其他疯草内生真菌完全不同。LAAO基因可能参与L-赖氨酸的合成或从L-赖氨酸到L-哌可酸合成途径的调控,KS基因可能参与从L-哌可酸到SW合成途径的调控,不同菌株KS基因核苷酸位点的突变可能与该基因的表达和SW合成调控相关。3.对UV、EMS和NTG诱变初筛获得的SW产率发生显著变化的26株候选突变菌株连续传代培养3代,对各菌株的SW产率进行检测和统计分析,筛选SW合成与对照株差异显著且稳定的突变菌株。结果表明,三次筛选共获得E-02,E-25,E-23 3株SW合成与对照株产率差异显著(p<0.05)且保持稳定的突变菌株,其中E-02菌株在连续传代培养后,SW产率与对照株差异极显著(p<0.01)。该研究可为进一步对疯草内生真菌进行转录组分析提供菌株。