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研究背景及目的超声是一种频率高于20000 Hz的声波,由于超声传播方向好,穿透能力强,易于获得较集中的声能,在水中传播距离远,因此可用于测距、测速、清洗、杀菌、消毒等。由于超声具有无创、穿透力深、易远程操作等优点,在医学诊疗中广泛应用,通常用于超声诊断的频率为1 MHz–30 MHz。目前在医学诊疗中主要用于超声的聚焦热能作用,如射频消融,超声刀等;超声的多普勒频移与回波扫描作用,如多普勒彩超与B超;而超声的空化作用主要用于口腔科的牙齿清洗与治疗。超声作用于物体时会产生超声辐射力,辐射力是指单位时间内物体单位表面积向半球空间发射的全部波长的辐射能。超声辐射力作用于细胞时,会在细胞表面产生剪切应力,进而影响细胞的各种生理功能。目前研究,超声辐射力主要通过细胞表面的机械敏感蛋白产生作用,如将高电荷机械敏感离子通道（Mscl）表达在小鼠神经元细胞,超声作用于细胞表面Mscl蛋白,低强度的超声波刺激可以激活小鼠神经元细胞;超声可以通过瞬时受体电位通道Trp-4调控秀丽线虫的感觉神经元,影响它的行为表现;超声也可以作用于细胞表面机械敏感离子通道蛋白Piezo1,启动钙离子内流,增加小鼠原代神经元中的核c-Fos表达,影响小鼠的学习、记忆功能等。Piezo1蛋白广泛分布于哺乳动物中,对超声敏感,有待深入的研究。蛋白Fam38A（Piezo1）是2010年Sciece上报道的一种非选择性钙离子机械敏感通道蛋白,Piezo1蛋白位于人类16q24.3,三叶螺旋状多数分布于细胞质膜与内质网膜上,由2521个氨基酸组成,分子量286790d。在人类肺、膀胱、肾、皮肤、骨骼肌肉、心血管系统等均表达。Piezo1蛋白是非选择性钙离子机械敏感通道,可以将机械力转导为生物信号,在哺乳动物中,机械转导影响胚胎发育、触觉、痛觉、本体感觉、听力、血管张力以及血流调节等,以维持机体各个器官组织的正常功能。Piezo1蛋白作为一种机械敏感离子蛋白,在目前的研究中,已经发现循环拉伸力介导Piezo1蛋白可以促进人骨肉瘤细胞的侵袭与凋亡,抑制细胞的增殖;循环拉伸力也可以诱发泌尿上皮细胞钙离子内流和ATP释放。而血流灌注力作用于Piezo1蛋白可以诱导ATP的释放以及下游信号通路P2Y2/Gq/G11的依赖性激活。由于流体剪切力作用于Piezo1蛋白对血管的生成和内皮细胞的排列具有明显的影响,而且轨道震荡力可以促进胎儿胚胎内皮细胞沿血流方向排列。由此推测,超声辐射力作用于血管内皮细胞将会影响内皮细胞的生物学功能。由于人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）Piezo1蛋白表达含量很高,且在血管形成、血压控制及心血管疾病的发生发展过程中发挥很大作用,所以,本课题采用人类脐静脉内皮细胞系做为研究对象。本课题搭建超声刺激平台和构建Piezo1蛋白表达抑制人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）系,采用超声刺激Piezo1抑制组和对照组细胞,确定超声辐射力对Piezo1蛋白的调控作用;通过对细胞内相关因子的检测,确定超声刺激Piezo1蛋白对HUVECs生物学效应的影响,为心血管系统疾病的治疗探索新的治疗方案。研究方法1.采用超声信号发生器,超声转换探头及共聚焦显微镜,组建超声-激光共聚焦实时检测细胞平台。2.设计si RNA序列,采用RNA干扰技术,瞬时转染si RNA构建Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株:Piezo1抑制组与对照组。3.钙离子荧光探针Fluo-4,AM法检测细胞内钙离子含量,设置Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株外钙离子环境参数,超声刺激强度和时间参数。4.荧光素-荧光素酶法检测Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株内ATP的含量;ELISA法检测细胞株内肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对细胞通透性的影响。5.荧光探针DAF-FM DA法检测Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株内一氧化氮（NO）的含量;ELISA法检测细胞株内环磷酸鸟苷（c GMP）和血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对血管收缩和舒张的影响。荧光探针法检测Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株内活性氧（ROS）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对细胞内ROS含量的影响。6.超声刺激作用于HUVECs样本后,样本RNAsequence信息采集与分析;ELISA法检测人上皮中性粒细胞活化肽78（ENA-78/CXCL5）和人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL/LCN2）的含量,探究超声刺激和Piezo1蛋白对免疫相关炎性因子的影响。研究结果1.细胞模型构建:利用瞬时转染si RNA成功构建Piezo1蛋白表达抑制HUVECs细胞株,抑制效率达到80%（P<0.01）。2.超声刺激环境和刺激功率强度:细胞外液钙离子环境有利于钙离子内流,超声刺激过程中需要细胞外液体中具有一定的钙离子浓度,细胞内钙离子浓度40 min后达到稳定;超声刺激时间和功率均会影响钙离子内流,超声刺激功率1w,刺激时间15 s,大部分细胞破碎死亡,刺激功率0.2 w,刺激时间15 s,只有个别细胞破碎,后续实验0.2 w为合适功率;当超声功率为0.2 w时,刺激时间分别采用1 s、5 s、10 s,发现刺激时间10 s时,细胞形态发生轻微改变,后续实验超声刺激以小于10 s为合适时间。3.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内钙离子浓度、ATP及MLCK的调控:按照设定的细胞外液环境钙离子浓度和超声波参数,作用于Piezo1抑制组和对照组细胞;在0.2 w下,分别采用了1 s、5 s、8 s、10 s超声刺激时间,发现随着刺激时间增加,细胞钙离子内流量不断增加,且Piezo1抑制组的钙离子内流量比对照组低（1 s和5 s时,P<0.01,8 s和10 s时,无差异）;通过检测Piezo1抑制组与对照组内ATP的含量,发现随着刺激时间的增加,细胞内消耗的ATP量逐渐升高,且Piezo1抑制组消耗的ATP含量比对照组低（1 s和3 s时,P<0.05,5 s时,无差异）;通过检测Piezo1抑制组和对照组内MLCK的含量,发现随着刺激时间的增加,细胞内MLCK的含量逐渐增高,Piezo1抑制组中MLCK含量比对照组低（1 s时,P<0.05,3 s时,P<0.01,5 s时,P<0.05）。4.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内NO、c GMP及Ang-Ⅱ的调控:超声刺激作用于Piezo1抑制组和对照组细胞后,检测细胞内NO含量,随着刺激时间的增加,细胞内NO荧光含量逐渐降低,并且Piezo1抑制组中NO生成比对照组少（1 s时,P<0.01,3 s和5 s时,P<0.001）;检测Piezo1抑制组和对照组内c GMP的含量,发现随着刺激时间的增加,细胞内c GMP的含量逐渐增高,并且在3 s时,Piezo1抑制组中c GMP含量比对照组含量低（P<0.01）,其它刺激时间无差异。检测Piezo1抑制组和对照组内Ang-Ⅱ的含量,发现刺激时间是3 s时,Piezo1抑制组中Ang-Ⅱ含量比对照组含量低（P<0.05）,其它刺激时间无差异。5.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内ROS的调控:超声刺激作用于HUVECs后,检测细胞内ROS含量,发现细胞内ROS含量随时间逐渐降低（P<0.01）;在给予Piezo1抑制组和对照组细胞3 s刺激时间,发现Piezo1抑制组ROS含量与对照组低相比,差异显著（P<0.01）。6.超声刺激Piezo1蛋白对细胞内免疫相关因子CXCL5和LCN2的调控:HUVECs给予超声3 s的刺激后,RNAsequence数据分析显示超声组细胞内CXCL5含量降低（P<0.05）,LCN2的含量增加（P<0.05）;超声刺激作用于Piezo1抑制组和对照组细胞1 s、3 s、5 s后,检测细胞内CXCL5的含量,发现刺激时间的增加使细胞内CXCL5含量逐渐降低,并且Piezo1蛋白的抑制也会引起细胞内CXCL5的含量降低（1 s时,P<0.05,3 s和5 s时,P<0.01）;超声刺激时间增加,细胞内LCN2的含量逐渐降低,而Piezo1蛋白的抑制会引起细胞内LCN2的含量增加（1 s和3 s时,P<0.05,5 s时,无差异）。研究结论1.超声刺激Piezo1蛋白对细胞膜的通透性具有调控作用。2.超声刺激Piezo1蛋白具有引起血管舒张的能力,并且能够减少细胞内的ROS含量。3.超声刺激Piezo1蛋白能够调控细胞免疫相关炎性因子CXCL5和LCN2。