论文部分内容阅读
聚多巴胺模板化羟基磷灰石(polydopamine-templated hydroxyapatite,tHA)是一种以多巴胺为模板,仿生合成晶体结构的纳米羟基磷灰石生物材料,其晶体形态和化学组分与天然骨组织的微观结构接近,具有促进间充质干细胞成骨分化和骨组织缺损修复再生的效应。将tHA作为支架材料应用于牙周骨组织工程领域,具有巨大的研究价值。然而,研究发现高浓度的tHA会引起细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)增高,ROS诱导的氧化应激损伤导致细胞活性和成骨能力降低。因此,提升tHA材料的生物相容性、防止氧化应激损伤、提高细胞活性和成骨能力是该材料在牙周组织工程应用中亟待解决的问题。据报道,治疗II型糖尿病的首选药二甲双胍(metformin,MET)具有抵抗氧化损伤、防止细胞衰老和凋亡的作用,这种作用可能与腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK)信号通路诱导的自噬密切相关。自噬是细胞应对损伤、炎症、衰老的重要保护机制,细胞通过自噬能够清除过量的ROS以及被ROS损伤的细胞器和蛋白质,降低ROS对细胞的损伤,维持细胞正常的生理功能。此外,还有研究报导MET具有潜在的促进间充质干细胞成骨分化和增加矿化结节形成,以及辅助控制牙周炎症的作用。本研究将MET与tHA材料结合用于牙周组织工程研究,通过体外和体内实验,探讨是否能够利用MET促进自噬,提高牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs)在tHA材料上的活性,并进一步促进细胞成骨分化和牙周骨组织修复再生。首先,本研究采用仿生法合成了tHA材料并对其进行理化性质表征。体外实验部分:用tHA联合MET培养h PDLSCs。通过检测细胞内ROS、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放、细胞凋亡周期、细胞增殖活性、细胞骨架染色评估细胞活性和材料生物相容性。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、钙结节茜素红染色、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)基因表达,评估牙周膜干细胞在tHA联合MET条件下的成骨分化效应。通过免疫印迹法(western blot,WB)分析自噬标志蛋白Beclin-1和LC3表达,以及AMPK/m TOR信号转导途径的磷酸化,阐明tHA联合MET诱导牙周膜干细胞自噬的机制。研究结果显示tHA联合MET显著减少h PDLSCs细胞内ROS积累,减少LDH释放,降低细胞凋亡和死亡率,提高细胞增殖活性,增强细胞骨架伸展和粘附。tHA联合MET明显提高h PDLSCs的ALP活性,增加矿化结节形成和成骨基因OCN、OPN和RUNX2的表达。tHA联合MET增强了自噬蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ的表达,并且激活AMPK通路,同时抑制m TOR信号的转导。体内实验部分:建立SD大鼠下颌第一磨牙根方牙槽骨缺损模型,骨缺损处植入tHA与MET复合物,10周后收集样本,通过Micro CT进行术区骨组织三维扫描重建,通过钙黄绿素和茜素红荧光标记新骨形成。结果发现tHA联合MET能够有效促进缺损处新骨形成,提高骨组织矿化速度,对牙周骨组织缺损有显著的修复再生效应。综上所述,本研究结果表明MET能够改善tHA材料生物相容性,提高h PDLSCs在tHA材料上的活性,并协同促进成骨分化效应。tHA生物相容性的提高可能与MET经AMPK/m TOR信号途径诱导的自噬密切相关。此外,tHA联合MET在体内对大鼠牙周骨组织缺损有明显的修复再生作用。因此,tHA联合MET在牙周骨组织修复再生领域具有巨大的应用潜力。