【研究背景】肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌的百分之八十到九十。肝癌的发病率死亡率均位于肿瘤前列,其中,我国肝癌的病死率位居所有肿瘤的第二位,仅次于肺癌。我国肝癌患者被诊断时多已处于进展期或晚期,同时伴随着血行转移和癌栓形成,直接导致我国肝癌术后五年生存率与欧美发达国家相比处于较低的水平。因此,如何治疗肝癌和改善肝癌手术的预后尤为重要。目前,化疗是临床上治疗肝癌常用的手段之一。常用的化疗药物有索拉非尼、贝伐单抗、舒尼替尼、厄洛替尼等。索拉非尼(Sorafenib,SOR)是多激酶抑制剂,主要通过抑制肿瘤血管的生成抑制肿瘤进展,在中晚期肝癌的治疗中取得了较好的效果,能显著延长中晚期肝癌患者的生存期。然而,临床研究发现在索拉非尼治疗中,会有一部分患者对其产生耐药性,并会产生一定的毒副作用,给该药物的临床应用造成较大的影响。因此,深入研究索拉非尼的耐药机制、提高其疗效已成为索拉非尼抗肿瘤研究的热点之一。近年来的研究表明,从中草药中提取的多种活性成份具有较好的抗肿瘤潜力。中药活性成分联合化疗药物使用可以有效降低其耐药性,减少毒副作用,提高其抗肿瘤活性。蟾毒灵(Bufalin)是从瞻蜍科动物中华大蟾酥的耳后腺干燥分泌物中提取出来的主要活性成分,具解毒、止痛、开窍醒神的功效。研究表明,蟾毒灵能够抑制拓扑异构酶11的活性,干扰细胞DNA复制,可抑制血管内皮细胞增殖和抑制血管生成。研究发现,蟾毒灵可以显著抑制子宫内膜异位细胞以及卵巢癌、前列腺癌等的生长。已有报道显示,蟾毒灵联合索拉非尼可通过激活m TOR通路,或抑制VEGF(血管内皮因子,vascular endothelial growth factor)的表达等抑制肝癌的进展,取得很好的抗癌效果。然而,蟾毒灵联合索拉非尼抑制肝癌进展的分子机制有待进一步研究。本课题通过研究蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌增殖的抑制作用,并通过研究其对肝癌细胞线粒体功能的影响,初步探讨其抑制肝癌细胞增殖的分子机制。【研究目的】通过体内体外实验探索蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌细胞SNU-739增殖的抑制作用及相关分子机制。【研究方法】1、采用MTT、克隆形成实验、LDH生成检测、划痕实验等研究不同浓度蟾毒灵、索拉非尼以及索拉非尼与索拉非尼联合对肝癌细胞的增殖抑制作用;2、通过流式、DAPI、q PCR、WB、TUNEL、EDU等方法研究蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌细胞线凋亡的影响;3、通过检测线粒体膜电位JC-1、ATP生成、ROS生成等研究蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌细胞线粒体功能的影响;4、裸鼠异种移植模型研究蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌细胞体内增殖的抑制作用。【研究结果】第一章1、通过MTT实验检测出蟾毒灵抑制肝癌细胞的增殖,并计算得出IC50为500n M。LDH检测出蟾毒灵对肝癌细胞毒性作用,显微镜下观察可以看到给药后肝癌细胞的形态发生变化,克隆形成和EDU实验验证了蟾毒灵对肝癌细胞增殖的抑制作用。划痕实验结果显示蟾毒灵抑制肝癌细胞迁移。第二章1、通过MTT实验,蟾毒灵和索拉非尼联合用药对肝癌细胞的抑制作用明显大于蟾毒灵和索拉非尼单独用药。蟾毒灵和索拉非尼联合用药还能减少索拉非尼对正常细胞的抑制作用。2、LDH实验得出联合用药对肝癌细胞毒性更大,克隆形成实验和EDU增殖实验得出联合用药抑制肝癌细胞增殖效果较好,在显微镜下观察也可得出这点。3、通过异种瘤移植实验和免疫组化实验得出蟾毒灵和索拉非尼在裸鼠体内抑制肝癌增殖。第三章1、通过DAPI染色看到肝癌细胞核出现凋亡形态、TUNNEL染色可以得出蟾毒灵联合索拉非尼比例增多,同时流式实验证实联合用药凋亡细胞率远大于单药组,蟾毒灵联合索拉非尼抑制肝癌细胞的增殖是诱导肝癌细胞凋亡。2、JC-1线粒体膜电位检测联合用药肝癌细胞膜电位降低,线粒体ATP生成下降,同时检测ROS生成增多。可以得出蟾毒灵联合索拉非尼通过线粒体相关途径诱导肝癌细胞SNU-739凋亡,抑制肝癌细胞SNU-739增殖。【研究结论】以上实验结果表明,蟾毒灵和索拉非尼在体内外均能显著抑制肝癌细胞增殖,并能通过线粒体途径促进肝癌细胞的凋亡。同时,蟾毒灵联合使用还可以减小索拉非尼的用量及对正常肝细胞的损伤。