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功能核酸主要包括核酸适体和核酸酶。与传统的核酸以线性序列形式作为遗传信息载体不同,功能核酸利用分子内作用力折叠成稳定的三维结构,并通过该高级结构发挥结合配体和催化的功能。核酸适体是一类具有靶标识别功能的单链寡核苷酸,研究者们已经筛选获得了特异性结合小分子、蛋白、细菌、病毒及细胞等靶标的高亲和力核酸适体,应用在分子检测、蛋白分离、免疫调控、药物递送等多个领域。核酸酶是一类具有催化活性的单链核酸分子,一般由结合结构域及催化核心组成。在特异识别和结合底物后,核酸酶可催化底物发生断键、成键等多种类型的反应。根据反应条件及底物的不同,核酸酶主要被应用在离子检测及基因沉默等方面。随着研究的不断深入,科学家们发现天然核酸在生物环境中易被核酸酶降解,其稳定性不能满足实验需求。另外天然核酸的官能团较少,化学多样性也相对有限。为了增强核酸的生物稳定性和化学多样性,开发性能更出色的功能核酸,拓宽应用范围,研究者们对核酸的磷酸、糖环及碱基进行诸多修饰,获得一系列带有化学修饰的核酸单体。在相应聚合酶的辅助下,研究者们可以筛选得到化学修饰的功能核酸,这些化学修饰的功能核酸抗酶降解能力更强、与靶标分子的亲和力更高。应用于细胞及活体水平时,生物稳定性好,能长时间保持活性,具有应用于生物技术、疾病诊断及药物开发等方面的潜能。本论文,主要开展了三方面的工作:（1）免疫印迹（immunoblotting,Western blot）是实验室常用的特异性蛋白质检测和定量的方法,依赖于抗体与目的蛋白的高选择性和高亲和力结合。相比于抗体,核酸适体的优势包括:生成成本低、变性后可复性、易于化学修饰等。在这部分工作中,我们将荧光修饰的核酸适体用于Western blot的蛋白检测中,简化了操作步骤,节省了实验时间,降低了经济成本。我们以三个常用的标签蛋白谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase,GST）、聚组氨酸标签（polyhistidine tag,His-tag）和甘露糖结合蛋白（maltose-binding protein,MBP）为靶标蛋白,基于Western blot方法进行体外筛选,获得了靶向GST的核酸适体G1和G2,靶向His-tag的核酸适体H1和H2,靶向MBP的核酸适体M1,这些核酸适体结合靶标的亲和常数都在纳摩尔每升水平。进一步,我们发现核酸适体G1可以有效区分以上三种不同蛋白,特异结合靶蛋白GST,具有比抗体更高的特异性。最后研究发现,G2、H2和M1可以识别标签融合蛋白,拓宽了这些核酸适体的应用范围。这项工作发展了应用于免疫印迹中选择性识别蛋白质的核酸适体筛选方法,这项工作中开发的基于核酸适体的蛋白质免疫印迹方法具有操作简便、成本低、通用性好等特点。（2）膀胱癌是泌尿系统发病率最高的癌症之一,目前临床治疗手段主要是手术切除和术后化疗。化疗药物由于缺少靶向性,会造成严重的毒副作用。为了构建高效低毒的靶向载药体系,为膀胱癌治疗提供新方案,本论文的第二部分工作是以膀胱癌细胞T24为靶标进行具有细胞识别和内化能力的化学修饰核酸适体筛选（Cell-internalization SELEX）,获得了特异内化膀胱癌细胞的化学修饰核酸适体B1,我们探讨了核酸适体B1内化细胞的机制及潜在的靶标。最后我们构建了以核酸适体B1为靶向基团的纳米火车载药体系,发现该靶向载药体系能够特异内化膀胱癌细胞,降低化疗药物对正常膀胱上皮细胞的毒性作用。活体水平的实验也表明我们构建的靶向载药体系有更好的抑制原位膀胱肿瘤生长的效果。这项工作开发了第一个靶向膀胱癌细胞的化学修饰的核酸适体,以核酸适体B1为靶向基团的纳米火车载药体系明显提高了化疗药物抑制肿瘤生长的效果。这项工作为膀胱癌的治疗提供了新方案,具有应用于临床的潜力。（3）RNA具有丰富的结构和功能多样性,因此科学家们提出了“RNA世界假说”,认为地球早期生命形式既使用RNA作为遗传物质,又利用RNA折叠形成的核酶催化代谢反应,但是在演化过程中RNA是否是第一种遗传物质,以及RNA是否是唯一可能的遗传物质尚未可知。研究发现苏糖核酸（threose nucleic acid,TNA）可以与互补的RNA及本身形成稳定的双螺旋结构,而且糖环更加简单,因此被认为是一种可能的RNA前体。作为地球早期生命形式的遗传物质要求TNA能像RNA折叠成核酶一样,形成具有催化活性的高级结构。在本论文第三部分的工作中,我们的目标是利用体外筛选技术鉴定具有RNA连接酶活性的TNA序列。在经过8轮体外筛选及截短优化后,我们获得了TNA酶T8-6。它催化两段RNA底物发生连接反应,形成一个新的2’-5’磷酸酯键。T8-6要求连接位点附近的4个碱基是UA|GA,对底物序列其他位置的碱基变化具有一定的通用性。T8-6催化的反应在p H 9.0时表观速率常数为0.011 min-1。T8-6的催化活性对Mg2+呈浓度依赖,并且在40 m M时活性最高。另外T8-6对二价金属离子具有选择性,当Mn2+、Zn2+和Co2+和Cu2+存在时,T8-6仍具有较低的催化活性。最后,我们证实T8-6可以催化生成有功能的RNA分子。我们利用T8-6制备了含有一个2’-5’磷酸酯键的锤头核酶,它与化学合成的天然全3’-5’连接序列具有类似的切割活性。这项工作通过体外筛选的方法,首次获得了具有催化RNA连接酶活性的TNA序列,既为TNA是RNA的前体分子提供了有力的实验证据,又为核酸化学等领域的研究提供了新型的非天然核酸分子工具。这项工作建立的筛选方法可以推广到其他非天然核酸酶的筛选中,促进研究者们开发更多的功能核酸,应用于分子检测与疾病治疗等诸多方面。在本论文中,我们利用Western blot法筛选获得应用于免疫印迹的核酸适体,极大地简化了免疫印迹分析的实验流程,实现对靶标蛋白的一步成像。其次,我们开发了特异识别和内化膀胱癌细胞的化学修饰的核酸适体,构建的核酸适体-药物复合体能够特异杀伤癌细胞,在活体水平抑制膀胱原位肿瘤生长的效果也优于游离药物分子,为膀胱癌的临床治疗提供新策略。此外,我们还获得了具有RNA连接酶活性的TNA序列,为TNA是生命早期的遗传物质提供实验支撑。这些工作都为功能核酸的开发及应用研究提供实验基础,促进功能核酸领域的进一步发展。