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肿瘤细胞线粒体功能障碍与肿瘤细胞存活、增殖与转移紧密相关,在维持肿瘤细胞正常生命状态中扮演着重要角色。肝癌细胞线粒体DNA在细胞色素c氧化酶与NADH脱氢酶等保守位点的突变,可能会抑制肝癌细胞的氧化磷酸化,促进肝癌的发生与发展。现有研究表明,外源线粒体移植能够抑制肿瘤细胞的增殖并改变其呼吸状态,但其作用机制并不明确。另有研究报道,雄性小鼠来源线粒体（Mitochondria from male mice,M-Mito）与雌性小鼠来源线粒体（Mitochondria from female mice,F-Mito）在呼吸能力和线粒体活力上存在差异。本课题拟探究外源线粒体对H22肝癌的抑制作用及机制,并比较M-Mito与F-Mito对肝癌抑制作用的差异,为肝癌的治疗提供一种新策略。在体外实验中,首先测定了M-Mito和F-Mito的线粒体膜电位、琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）与线粒体异柠檬酸脱氢酶（Mitochondrial isocitrate dehydrogenase,Mito-ICDH）的活性。结果表明,F-Mito的线粒体膜电位、SDH与Mito-ICDH活性都要高于M-Mito,由此判断,F-Mito的线粒体活力高于M-Mito。然后,使用免疫荧光验证了外源线粒体能够进入H22细胞。此外,采用CCK-8法测定了经0～400μg/m L M-Mito与F-Mito分别处理后H22细胞8 h后,H22细胞增殖活力变化。结果显示,线粒体浓度在100～400μg/m L时,外源线粒体能够显著抑制H22细胞增殖,并且F-Mito对H22细胞增殖的抑制作用要优于M-Mito。最后,使用流式细胞技术测定了经200μg/m L M-Mito与F-Mito分别处理H22细胞4 h后,H22细胞周期与凋亡的变化。结果显示,外源线粒体能够显著阻滞H22细胞周期、促进细胞凋亡,并且F-Mito对H22细胞周期的阻滞作用与凋亡的促进作用要优于M-Mito。以上结果表明,在体外,外源线粒体可能通过阻滞H22细胞周期,促进细胞凋亡来抑制H22细胞的增殖,并且F-Mito抑制肿瘤细胞增殖的能力要优于M-Mito,为体内实验研究提供了一个基础。在体内实验中,首先通过H22肝癌皮下移植瘤模型来评价M-Mito与F-Mito对H22皮下瘤生长的抑制作用。连续给药治疗6天后,外源线粒体治疗组肿瘤体积和重量与模型组相比显著下降,并且F-Mito治疗组肿瘤体积与重量下降更为明显。然后,通过对肿瘤组织进行HE染色、Ki-67免疫组化与TUNEL染色,发现外源线粒体能够增加肿瘤组织坏死区域、下调肿瘤组织中Ki-67的表达与诱导肿瘤组织中肿瘤细胞发生凋亡,并且F-Mito治疗组对应的结果都优于M-Mito治疗组。以上结果表明,外源线粒体在体内能够抑制H22皮下瘤的生长,并且F-Mito对肿瘤的抑制作用要强于M-Mito。为了探究外源线粒体抑制H22皮下瘤生长的机制,本实验首先检测了肿瘤组织氧化还原、糖酵解与三羧酸（Tricarboxylic acid,TCA）循环相关指标的变化。结果显示,外源线粒体治疗组超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性、过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性、还原型谷胱甘肽（GSH）含量与总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）都显著提高,与之相反,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量显著降低。结果表明,外源线粒体可能通过提高SOD活性、CAT活性与GSH含量来提高肿瘤组织T-AOC,从而降低肿瘤组织本身较高的ROS含量,使其接近正常水平,以消除内源性ROS对肿瘤细胞的刺激。此外,线粒体治疗组与肿瘤细胞有氧糖酵相关的己糖激酶（Hexokinase,KH）活性、乳酸含量与ATP含量都显著降低,与之相反,线粒体治疗组与细胞TCA循环相关的丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase,PDH）、SDH与Mito-ICDH的活性都显著升高。说明,外源线粒体在抑制肿瘤细胞糖酵解的同时还促进了TCA循环的发生,证明外源线粒体在体内能够促进肿瘤细胞代谢状态由有氧糖酵解向氧化磷酸化转变。流式检测结果与组织病理切片染色结果都提示外源线粒体抑制肿瘤生长的分子机制可能同细胞周期与细胞凋亡有关。因此,本实验紧接着使用Western Blot（WB）对细胞周期相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白以及相关调控因子的表达量进行了检测。结果显示,外源线粒体能够显著下调Fox M1、Cyclin D1、Cyclin A2与CDK1的表达,同时Fox M1的调控因子HIF-1a也显著下调。而HIF-1a在细胞浆中的稳定性既受到ROS调控,也受到SDH经脯氨酸羟化酶2（Proline hydroxylase 2,PHD2）进行调控。WB结果显示,外源线粒体能够显著上调PHD2的表达。结合外源线粒体对肿瘤细胞ROS与SDH的影响,结果表明,外源线粒体可能通过降低ROS含量与增加SDH活性解除琥珀酸对PHD2的抑制两者共同作用,促使HIF-1a在细胞浆中快速裂解,下调Fox M1的表达,进而下调Cyclin D1、Cyclin A2与CDK1的表达来阻滞细胞周期。此外,外源线粒体还能够显著下调p-Bad与Bcl-2的表达,同时显著上调Bax、Caspase-9与Caspase-3的表达。而p-Bad的磷酸化水平受到糖酵解的调节。结合外源线粒体对肿瘤细胞糖酵解的影响,结果表明,外源线粒体可能通过抑制糖酵解,促进p-Bad的去磷酸化,下调Bcl-2的表达,进而上调Bax、Casepase-9与Caspase-3的表达来促进细胞凋亡。在相应结果中,F-Mito治疗组的数据优于M-Mito治疗组。综上所述,外源线粒体在体内与体外都能抑制H22细胞的增殖。其作用机制可能是通过增加肿瘤细胞SDH活性与下降ROS含量共同作用,促进HIF-1a在细胞浆中降解,下调Fox M1的表达,进而下调多个细胞周期相关蛋白的表达来阻滞肿瘤细胞周期。此外,外源线粒体抑制肿瘤生长的机制也有可能是通过抑制肿瘤细胞糖酵解,经p-Bad/Bcl-2/Bax/Caspase-9/Caspase-3信号通路促进肿瘤细胞凋亡。并且,F-Mito对肿瘤生长的抑制作用要优于M-Mito,其可能与F-Mito活性高于M-Mito活性有关。